絲裂霉素在兔離體角膜中的滲透特性研究

王石健，應苗法

0 引言

絲裂霉素是頭狀鏈霉菌中分離得到的一種毒副作用少的抗代謝成分，具有苯醌、烏拉坦和乙烯亞胺3種有效基團，在機體內絲裂霉素中的苯酯還原成為雙功能烷化基團，可使互補的DNA雙鍵之間產生交叉連接，選擇性抑制RNA合成，抑制增殖期DNA復制，對增殖各期細胞和靜止期細胞均有抑制作用［1］。臨床用于治療消化道癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結腸直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤。絲裂霉素亦可抑制成纖維細胞的增殖及轉移，并阻止成纖維細胞產生膠原物質，同時可阻止血管的再生，其抗瘢痕效果優于其他抗代謝藥，在眼科領域使用廣泛［2-3］。但是絲裂霉素在眼部的應用也伴隨著較少見而嚴重的不良反應［4］，主要有角膜水腫、角膜穿孔、眼部感染、鞏膜鈣化、鞏膜軟化、鞏膜潰瘍、虹膜炎、繼發性青光眼等。另外，絲裂霉素的穩定性比較差，也限制了其應用的進一步推廣。為了克服現有絲裂霉素給藥系統的缺點，新型的絲裂霉素眼用給藥系統也在不斷的開發中［5-8］，包括新型滴眼劑、眼用膜劑、眼用溫敏凝膠、可降解植入劑等。藥物在角膜中的滲透特性對給藥后藥物在眼部的分布、作用與消除均有重要的影響，是眼部給藥系統設計時需要重點考慮的因素。本研究采用兔角膜為模型，使用水平式擴散儀考察了絲裂霉素在離體角膜中的滲透特性，為絲裂霉素新型眼用給藥系統的開發提供參考。

1 方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀，配備G1310A泵，G1314A紫外檢測器，7255i手動進樣器，TC100柱溫箱(Agilient 1100，美國)，水平式擴散池(AH-6，上海鍇凱科技有限公司，接受室與供應室體積均為4 mL)，分析天平(AL204，梅特勒-托利多公司)。

1.1.2 試劑 絲裂霉素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:130438-200502)，絲裂霉素注射液(浙江海正藥業，規格10 mg，批號:120401)，谷胱甘肽氧化型(上海生工生物工程有限公司)，甲醇為色譜純(德國默克)，其余試劑均為分析純。

1.1.3 實驗動物 新西蘭兔(雄性，2 kg左右，浙江省醫學科學院)

1.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相:甲醇∶水 =70∶30，v/v，流速:1 mL/min，檢測波長:365 nm，柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL。

1.3 溶液制備 谷胱甘肽緩沖液的配制［9］:A液:氯化鈉12.4 g，氯化鉀0.716 g，磷酸二氫鈉0.206 g，碳酸氫鈉4.908 g，用水溶解并定容至1L;B液:谷胱甘肽氧化型0.184 g，氯化鈣0.23 g，氯化鎂0.318 g，葡萄糖1.8 g，用水溶解并定容至1 L。分別置4℃保存，臨用前混合。

精密稱取絲裂霉素對照品約10 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，即得絲裂霉素的對照品貯備液。將對照品貯備液適當稀釋即得絲裂霉素的對照品溶液。

1.4 系統適應性試驗 分別取空白接受液、絲裂霉素對照品溶液和樣品溶液20 μL進樣，記錄色譜圖，考察釋放介質及其他角膜浸出物質對絲裂霉素的測定有無干擾。

1.5 標準曲線 用甲醇將絲裂霉素貯備液稀釋成濃度為 0.2、1、2、5、10、20 μg/mL 的溶液，分別進樣，記錄峰面積。以峰面積(C)對濃度(C)進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.6 回收率 分別取絲裂霉素貯備液適量，用空白接收液稀釋成濃度為1、5、10 μg/mL的溶液，HPLC測定，計算回收率。

1.7 精密度與穩定性 分別取用空白接收液稀釋成濃度為 1、5、10 μg/mL 的絲裂霉素溶液，HPLC連續測定6次，記錄絲裂霉素的峰面積，計算RSD，考察精密度;取濃度為5 μg/mL的絲裂霉素溶液在溫室下12 h內不同時間HPLC測定，記錄絲裂霉素的峰面積，計算RSD，考察穩定性。

1.8 離體角膜滲透實驗

1.8.1 離體角膜的制備 新西蘭兔耳緣靜脈注射空氣處死后，立即使用眼科鑷和手術刀分離角膜，除去鞏膜、虹膜、睫狀體等組織，置于4℃谷胱甘肽緩沖液中備用。

1.8.2 角膜滲透試驗 取新鮮制備的離體角膜，置于水平式擴散池的供應室和接收室之間，角膜外側面朝向供應室。在接受室內加入4 mL谷胱甘肽緩沖液作為接收液，供應室內加入0.02%絲裂霉素溶液4 mL，水浴溫度設置34℃，磁力攪拌速度為 250 r/min。分別在試驗開始后 1、2、3、4、6 h取樣1 mL，并補充等量同溫的新鮮接收液。樣品經0.45 μm濾膜過濾后，取續濾液HPLC測定峰面積，按照標準曲線計算濃度，計算累積透過量。以累積透過量對時間作圖，即得絲裂霉素在離體角膜的滲透曲線。

1.8.3 滲透特性分析 將所得絲裂霉素的滲透曲線按照不同的動力學方程進行擬合，考察其滲透特性。

2 結果

2.1 系統適應性 絲裂霉素的系統適應性實驗結果如圖1所示。HPLC測試時間約17 min，絲裂霉素的保留時間約12.5 min，峰形良好，在絲裂霉素的保留時間處無其他雜質干擾測定。

圖1 絲裂霉素的高效液相色譜圖

2.2 標準曲線 以絲裂霉素的峰面積A對濃度C作線性回歸，得標準曲線:A=28.081C+0.719，r=0.999 9，結果顯示，絲裂霉素在 0.2～20 μg/mL的范圍內線性關系良好，滿足測試要求。

2.3 回收率 絲裂霉素回收率的結果如表1所示，結果顯示，絲裂霉素在高中低各濃度的回收率良好，平均回收率為99.70%，符合測定要求。

2.4 精密度與穩定性 低中高濃度絲裂霉素精密度試驗 RSD分別為 0.62%、0.22%、0.14%(n=6)。結果顯示絲裂霉素在各濃度下精密度良好。濃度為5 μg/mL的絲裂霉素在溫室下放置，分別于1、2、4、6、8、12 h 測定，RSD 為 0.89%。結果顯示絲裂霉素在12 h內穩定。

2.5 角膜滲透試驗 絲裂霉素在離體角膜中的滲透性能如圖2所示。

表1 絲裂霉素的回收率

圖2 絲裂霉素經過角膜的滲透曲線(n=6)

2.6 分析 將絲裂霉素經過角膜的滲透曲線按照不同的動力學方程進行擬合，結果如表2所示。其中，按照一級動力學方程擬合所獲得的相關系數r值最高，故認為絲裂霉素在角膜的滲透符合一級動力學方程。

表2 絲裂霉素滲透特性的擬合結果(n=6)

3 討論

絲裂霉素紫外吸收較高，一般常采用HPLCUV測定，即可達到精密度和檢測限的要求。有文獻報道使用梯度洗脫法［9］、緩沖鹽溶液作為流動相［10］測定絲裂霉素，操作比較復雜、實驗條件要求較高。有報道稱使用甲醇和水作為流動相效果良好［11］。本研究采用甲醇∶水(70∶30，v/v)作為流動相，操作簡便，而且絲裂霉素在此流動相下保留時間適中，峰形對稱，且無雜質干擾，故使用此流動相進行分析。絲裂霉素在水中穩定性差，降解較快［12］，故本實驗的樣品在取樣后立即進行測定。穩定性試驗的結果顯示絲裂霉素在12 h內是穩定的，滿足測試的要求。

考察藥物在離體角膜中的滲透性能，通常采用透皮擴散池進行試驗。對于凝膠等半固體眼用制劑，通常采用直立式擴散池進行考察［13-14］。但是對于藥物溶液，若使用直立式擴散池，由于角膜表面的液體流動較慢，形成濃度較低的液層，會降低藥物的透角膜速度，故考察藥物溶液的角膜滲透特性時常采用水平式擴散池［15］。本研究因此采用水平式擴散池考察絲裂霉素的透角膜特性。

在離體角膜的滲透性研究中，通常采用谷胱甘肽緩沖液作為接收液的主要成分［16］，因為角膜在此緩沖液中可維持活性長達6 h［17］。接受液不僅需要能夠維持角膜的活性，還需要有容納藥物的能力。為了保持在滲透試驗過程中的漏槽條件，通常需要加入乙醇等物質增加藥物在接受液中的溶解度［19］。由于絲裂霉素的水溶解性良好，在本實驗中，單獨使用谷胱甘肽緩沖液即可滿足漏槽條件。

對于絲裂霉素在離體角膜中的滲透特性的方程擬合，評價標準是擬合方程的回歸系數?；貧w系數越大，說明擬合優度越好，絲裂霉素越可能是按照此種方式透過角膜。本研究采用了三種藥物透過介質常見的模型進行擬合，結果顯示絲裂霉素經角膜的滲透過程符合一級動力學方程，說明絲裂霉素在角膜的滲透具有一定的時滯，但隨著時間的延長，絲裂霉素的滲透速率逐漸增加。這提示我們在設計靶部位在眼內的給藥系統時，應設法延長絲裂霉素在淚液中的滯留時間;反之，設計作用于眼表的給藥系統時，則應縮短絲裂霉素在淚液中的滯留時間，以免藥物進入眼內引起副作用。

由于制劑給藥于眼部后的實際情況比較復雜，影響因素較多，例如結膜囊容量有限、淚液引流引起制劑流失或稀釋等，離體角膜的滲透試驗不能完全說明絲裂霉素在體內經角膜滲透的真實情況。

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