復方卡波姆前房注射構建大鼠慢性高眼壓模型的實驗研究

孫 河 龐國龍 尹麗穎

2黑龍江中醫藥大學

青光眼是以眼壓升高為主要體征，伴隨視神經損害和視野缺損為主要特征的眼部疾病。其為僅次于白內障的全球第二大致盲性眼病〔1-3〕。高眼壓是青光眼的最重要體征，臨床中往往結合病理性的視神經改變和視野缺損方可明確診斷并進行治療，但是臨床中患者的眼壓得到控制后，其視神經損害和視野缺損仍然處于下行狀態〔4〕。對于青光眼復雜多變的機制、演變過程以及有效治療方法等研究需要進行大量的動物實驗，然而實際中用于青光眼的發病機理、手術治療、視神經保護治療等研究的青光眼模型并不多見?，F在流行的青光眼慢性高眼壓模型大多為鞏膜上靜脈燒灼（或結扎）、小梁激光光凝或兩者的聯合，但是兩者在實際造模過程中技術要求相對較高，成模率較低，且死亡率較高，為了探尋一種操作相對簡單，技術含量要求低，造模成功率高且死亡率低的造模方法，2004年黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院眼科課題組應用復方卡波姆溶液制作兔慢性高眼壓模型〔5〕，獲得成功。本次實驗我們選擇SD大鼠作為實驗動物，用不同濃度復方卡波姆溶液制作大鼠慢性高眼壓模型，并與傳統造模方法作對照，發現卡波姆造模的效果確切，可操作性強，優于對照組。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與儀器藥品

SD大鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK-（京）2012-0001），卡波姆 940（Carbomer-940，CAS：9007-20-9，購自北京國人逸康科技有限公司），將其配制成含0.3%卡波姆和0.025%地塞米松（鄭州卓峰制藥有限公司，生產批號12100611)的復方卡波姆溶液（150 mg卡波姆粉劑放入盛有50 ml蒸餾水的100 ml燒杯中，并放入12.5 mg的地塞米松磷酸鈉注射液，用玻璃棒攪拌卡波姆并放入超聲設備內振蕩至全部溶解即可），pH 值為4。微量進樣器（德國 Eppendorf），Tonopen-avia筆式眼壓計（美國Mentor公司產品），研究型顯微鏡（OLYMPUS-BX60，日本），眼科手術顯微鏡（蘇州六六視覺醫療設備公司）。

1.2 動物及分組

健康SD大鼠29只，雌雄兼用，體重大約在250g左右，隨機分為5組，A、B、C、D組各6只，雌雄各半，均給予右眼前房不同劑量的復方卡波姆溶液注射，左眼為自身對造眼。D組給予右眼鞏膜上靜脈3條燒灼，左眼為自身對照眼。E組5只，為空白對照組。造模前測量所有大鼠眼壓，將眼壓大于21 mmHg或眼壓高于非手術眼5 mmHg的大鼠剔除，并補充符合條件的大鼠〔6〕。

1.3 造模方法

A組：10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉，0.5%丁卡因滴眼液滴右眼行表面麻醉，復方托吡卡胺滴眼液（美多麗）術眼散瞳，術眼每眼先用10 ul微量進樣器抽取房水5 ul，隨后用10 ul微量進樣器注射復方卡波姆溶液5ul緩慢進入前房，伴隨著卡波姆溶液的進入，顯微鏡下清晰可見卡波姆遇房水后瞬間變為白色絮狀物，部分卡波姆留在瞳孔區，形成瞳孔阻滯，部分卡波姆進入房角位置，形成房角阻滯（圖1，圖2）。注射完畢后用棉簽輕壓穿刺口，無房水外漏，棄掉棉簽。

B組：麻醉、散瞳同前，每只術眼先用10 ul微量進樣器抽取房水10 ul，隨后用10 ul微量進樣器注射卡波姆溶液10 ul緩慢進入前房，卡波姆進入前房情況同前。注射完畢后處置同前。

C組：麻醉、散瞳同前，術眼每眼先用20 ul微量進樣器抽取房水15 ul，隨后用20 ul微量進樣器注射卡波姆溶液15 ul緩慢進入前房，卡波姆進入前房情況同前。注射完畢后處置同前。

D組：腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg全身麻醉，并給予2%利多卡因結膜下注射，剪開上方結膜10點～3點位，輕柔、仔細分離下方筋膜及肌肉，充分暴露鞏膜上靜脈，可見2根分別位于上直肌旁，2根分別位于下斜肌旁，用加熱的大頭針燒灼靜脈主干，使靜脈封閉。如果燒灼成功，可見到被燒灼靜脈后方成一白線，近角膜緣端靜脈明顯充盈，給予燒灼3條靜脈。

E組：只做術眼前房穿刺，正常飲食、飲水。

手術完畢后，術后 1、3、5、7、14、28 d 給予測眼壓，每日術眼點可樂必妥滴眼液1次，連續點1周，每日顯微鏡下觀察結膜、角膜、前房的炎癥情況。

1.4 模型成功的判斷標準

眼壓大于21mmHg或眼壓高于非手術眼5mmHg，且高眼壓連續持續7天以上為造模成功〔6〕。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0（漢化版）軟件進行分析。兩組間的比較采用t檢驗，各項指標以±s表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 眼壓情況（表1）

A 組：基線眼壓：右眼（12.34±1.23）mmHg，左眼（13.04±0.43）mmHg。 6只右眼均形成高眼壓，高眼壓持續時間為20～30天，高眼壓范圍為（右眼）：（25.23±2.31）mmHg，眼壓峰值為 35～40 mmHg，青光眼模型成功率100%。左眼眼壓同術前。術后第3天眼壓開始上升，角膜輕度水腫，瞳孔區可見卡波姆阻滯，部分房角區可見卡波姆阻滯，前房炎性反應較輕，第2周開始出現虹膜新生血管，第3、4周虹膜新生血管明顯增多。

B 組：基線眼壓：右眼（12.14±1.02）mmHg，左眼（12.35±1.67）mmHg。 6 只右眼均形成高眼壓，高眼壓持續時間為20～30天，高眼壓范圍為（右眼）：（28.23±4.31）mmHg，眼壓峰值為 40～45 mmHg，青光眼模型成功率100%。左眼眼壓同術前。術后第1d眼壓即開始升高，角膜輕度水腫，瞳孔區可見卡波姆阻滯，部分房角區可見卡波姆阻滯，前房炎性反應適中，第2周虹膜新生血管開始出現，且新生血管較A組粗大，第3、4周數量增加。

C 組：基線眼壓：右眼（13.44±2.54）mmHg，左眼（13.35±2.67）mmHg。 6 只右眼均形成高眼壓，高眼壓持續時間為10～20天，高眼壓范圍為（右眼）：（30.56±3.45）mmHg，眼壓峰值為 45～50 mmHg，青光眼模型成功率100%。左眼眼壓同術前。術后第1 d眼壓即開始升高，角膜明顯水腫，瞳孔區可見卡波姆完全阻滯，部分房角區可見卡波姆阻滯，前房炎性反應明顯，該組在第2周開始有大鼠出現角膜軟化、擴張，角膜向前膨出，出現眼壓逐漸下降，大約第3周后期降至正常眼壓范圍，該組大鼠第1周末虹膜出現粗大的新生血管，且量大，在第2、3周時，已經布滿整個虹膜。

D 組：基線眼壓：右眼（13.32±2.13）mmHg，左眼（13.37±2.09）mmHg。術后第 2d 死亡大鼠 2 只。其中1只大鼠眼壓升高不明顯，其余3只眼壓升高，眼壓范圍為（25.54±2.45）mmHg，眼壓峰值為 25～30mmHg，高眼壓持續時間7～10天，造模成功率50%。左眼眼壓同術前。角膜輕度水腫，輕度前房炎癥反應。

E 組：眼壓：右眼（12.34±3.13）mmHg，左眼（12.54±3.21）mmHg。

表1 4組大鼠慢性高眼壓的比較（±s，mmHg）

表1 4組大鼠慢性高眼壓的比較（±s，mmHg）

注：“-”表示實驗結束

持續時間d 28 d 35 d.31 25.22±3.11 20.21±1.02 20～30.31 25.11±3.32 19.23±1.01 20～30 C 6 15 ul 25.1±2.22 26.32±2.11 27.23±2.33 28.87±5.21 24.11±2.67 24.11±2.67 - 10～20 D 6 燒灼 20.34±1.98 23.98±1.87 24.76±2.01 23.98±0.17 12.34±1.28 - - 7～10 E 5 穿刺 12.23±3.45 12.23±3.45 14.12±2.33 13.55±2.21 14.55±3.46 14.21±3.12 13.25±2.46

對于兩組間的比較我們采用t檢驗，A、B、C、D組眼壓升高后同E組空白組眼壓比較，均P＜0.05，差異具有統計學意義。說明慢性高眼壓的大鼠模型構建成功，但是各組的眼壓及大鼠的一般狀況有所不同，A、B組眼壓相對于C、D組眼壓升高平穩，持續時間較長，前房、角膜反應相對較輕，特別是B組的眼壓升高快、平穩，是較為理想的造模劑量。

2.2 光鏡結果

36 d后（實驗觀察完畢），每組選擇5只大鼠右眼做視網膜的組織切片觀察。

2.2.1 大鼠的正常視網膜結構：大鼠的正常視網膜結構光鏡下所見與人相似，呈明顯的結構分層。外核層細胞數最多，有3～5層；內核層細胞數較少，有2～4層；節細胞為單層，形態呈圓形或橢圓形，細胞核多偏于外側，細胞分布均勻、緊密，形態、大小相似?？梢郧宄乜吹絻冉缒?、神經纖維層、神經節細胞層、內叢狀層和內核層、外叢狀層、外核層等各層次（圖 3）。

2.2.2 各組高眼壓模型大鼠的視網膜結構：D組大鼠模型（高眼壓持續7～10 d）：神經節細胞排列稀疏，數目較空白組減少10.41%，但仍可見較多正常的神經節細胞，D組與空白組間節細胞數目比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。視神經纖維層輕度變薄，偶見淋巴細胞浸潤，內叢狀層水腫明顯，內核層細胞減少，外叢狀層加厚，外核層細胞層數減少（圖4）。C組大鼠模型（高眼壓持續10～20 d）：神經纖維層、視神經節細胞層及內叢狀層高度水腫增厚，層次欠清晰，其神經節細胞表現為部分細胞泡狀死亡，可見凋亡細胞，剩余神經節細胞形態出現輕度異常，主要為胞質減少，細胞形態紊亂，神經節細胞計數較空白組下降 29.59%（圖5），兩者之間差異有統計學意義（P＜0.05）。內核層細胞層幾乎為單層，外叢狀層水腫明顯增厚，空泡增多；內叢狀層及外核層細胞數減少。A、B組高眼壓模型（高眼壓持續28d左右）:RGCs數目下降38.19%，且與空白組之間差異有統計學意義（P＜0.01）。神經纖維層、視神經節細胞層及內叢狀層萎縮，變薄，層次較為清晰，可見較多淋巴細胞浸潤，外核層細胞排列稀疏（圖6）。

3 討論

科學有效的構建動物模型是進行實驗研究首要的必需條件，目前我國常見的用于制作疾病模型的動物為大鼠、兔和猴，猴由于價格昂貴且為國家特殊保護動物等因素限制了其廣泛應用于動物實驗研究。國內有研究使用兔制作動物模型，但是兔的房角結構與人眼差別較大，因此其實驗結果用于臨床還有一定的距離〔5-9〕。當前大鼠為眼科最常用的青光眼實驗動物，是因為鼠眼的解剖結構和生理特點同人類的眼球有眾多的相似點，例如小梁、schlemm管、睫狀體、視網膜血管、鞏膜上靜脈等，房水引流途徑也同人類相似〔10，11〕。 還有大鼠的眼壓呈周期性節律〔12，13〕，神經特異性烯醇化酶在發育成眼前節組織的神經嵴細胞中的分布、濾過結構、篩板的蛋白等〔14，15〕。 大鼠高眼壓模型與人類的青光眼病理變化相似，像視網膜神經節細胞的凋亡，篩板結構的破壞與再建，視神經軸突的損傷等〔15〕。大鼠種族穩定，容易排除干擾因素，使得結果更加科學、可信。大鼠價格低廉，較易獲得，便于飼養，可進行大規模的實驗。

文獻提供的青光眼高眼壓模型為激光光凝小梁網法〔16〕、鞏膜上靜脈封閉誘導法兩種〔17，18〕，其中激光光凝小梁法通過光凝小梁網影響房水的回流引起眼壓升高，該辦法需要特制的激光治療儀，技術要求比較高，并且需要多次重復打激光以維持高眼壓狀態，因此并不是理想的造模方式。鞏膜上靜脈封閉也是流行的造模方法之一，或進行縫線結扎，或進行燒灼靜脈，或用激光進行光凝靜脈，其原理為封閉鞏膜上靜脈阻止房水外流以達到眼壓升高的目的。我們此次實驗D組選擇了燒灼靜脈法，效果并不是很理想，眼壓未有明顯提高，即使個別大鼠眼壓升高，但在4～5天后眼壓又會下降到正常范圍，且死亡率較高，還有的模型眼眼壓升高不明顯，升高后維持時間短等情況。因此用該造模方法升高眼壓與維持高眼壓狀態的時間有待商榷。

我們采用了前房注射不同劑量的復方卡波姆溶液進行觀察，并采用了現在比較流行的燒灼鞏膜上靜脈法作為比較組進行眼壓升高的參照，在實驗中我們發現A組模型（低劑量卡波姆）眼壓升高相對較慢，升高眼壓較為平穩，眼壓升高時間相對較長，前房反應相對較輕，無明顯角膜軟化、凸出情況等。B組模型（中劑量卡波姆）眼壓升高較快，術后第1日即升高，且眼壓較為平穩，眼壓升高時間相對較長，基本同A組，前房反應也較輕，無明顯的角膜軟化、凸出情況等。C組模型（高劑量卡波姆）眼壓升高同樣較快，術后第二日即升高，但是部分大鼠的角膜在第二周開始出現軟化、凸出，眼壓開始緩慢下降，大約在第三周降至正常范圍內。D組大鼠模型為燒灼鞏膜上靜脈造模的模型，造模后第2日即有2只大鼠死亡，且眼壓升高緩慢，持續時間相對較短，有1只大鼠眼壓升高不明顯，該組大鼠前房反應較輕，角膜狀況好，但是造模成功率低，同其他文獻報道的較高的造模成功率有差距〔19〕。我們通過實驗得出結論，B組模型10 ul劑量組為理想的卡波姆造模劑量，該組大鼠模型升高眼壓快，眼壓升高穩定，維持高眼壓約為28天左右，是較為理想的高眼壓時間窗，并且并發癥少。下一步的實驗我們將采取10 ul劑量作為造模劑量，進行后續的一系列實驗。為進一步驗證高眼壓造成的視網膜損傷，我們觀察了高眼壓持續7～10天、10～20天、28天左右的高眼壓大鼠視網膜改變，通過光鏡觀察發現視網膜厚度逐漸變厚，最后逐漸變薄，考慮為早期和中期高眼壓造成了視網膜漸進性水腫，后期由于長時間缺血、缺氧造成了視網膜逐漸萎縮變薄。視網膜神經節細胞數量隨著高眼壓時間的延長而逐漸下降，說明了高眼壓對視網膜形成了損害，造成了視網膜的厚度、顯微結構、神經節細胞數量的變化，同時也進一步驗證了慢性高眼壓模型的構建成功。

卡波姆為丙烯酸鍵合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物，是一類重要的流變調節劑，中和后的卡波姆是優秀的凝膠基質，廣泛應用于乳液、膏霜、凝膠中，是優良的藥劑新輔料。其最大特點：（1）當pH值低時呈溶液狀，隨著pH值的升高，溶液的黏稠度逐漸增加而變成凝膠狀，當且僅當pH值在6～12時最為黏稠；（2）具備較好的乳化性、增稠性、助懸性以及成膜性。這些特性使得卡波姆在制藥中得到了廣泛的應用〔20，21〕。根據卡波姆隨著 pH 值發生變化的特點，分析注入前房的卡波姆溶液在房水作用下，隨著pH值的升高，變為凝膠狀阻滯瞳孔和房角造成房水排出受阻，從而形成高眼壓，基于此種設想，我們進行了大鼠前房注射卡波姆溶液形成高眼壓的動物實驗。根據大鼠前房狹小的情況，我們分成3個不同的劑量進行觀察，觀察哪個劑量的模型眼壓升壓快、穩定、并發癥少而輕、安全性好、可用性強，找出模型的最佳劑量。對于成功的高眼壓模型，我們觀察其造模后的眼壓升高情況，并于眼壓觀察完畢后，于實驗的第36d從各組選出5只大鼠進行光鏡下觀察視網膜顯微結構變化，以及視網膜神經節細胞數量變化。

復方卡波姆誘發大鼠青光眼模型的優點：（1）眼壓升高較穩定，可使眼壓保持足夠長的時間，因此我們可使用大鼠高眼壓模型研究青光眼視乳頭形態學改變，視網膜神經節細胞及軸索損害等病理生理過程，以及藥物干預對其的保護作用等。（2）該模型眼壓平穩上升的原因，我們分析為隨著房水的不斷分泌，前房的pH值也處于不斷升高狀態，導致前房內卡波姆凝膠的黏稠度不斷增加，加大了房水流出易度。（3）使用卡波姆溶液誘導大鼠青光眼，方法簡單，成本低廉，易于操作和控制，對操作人員的操作技能要求低，適合大范圍推廣。（4）眼壓升高持續時間近1個月，按人與大鼠壽命折算，相當于人高眼壓一年半，完全可用于進行各種抗青光眼藥物降眼壓作用和視神經、視網膜保護作用的藥物研究。

復方卡波姆溶液誘導大鼠青光眼模型的缺點:引起部分眼球結膜充血、角膜水腫、輕度前房滲出、對光反應減弱等一系列并發癥，分析原因可能為卡波姆引起眼壓增高的繼發性反應。前房的炎性反應，可能與注入前房的卡波姆pH值較低或是卡波姆作為異物的刺激有關。我們運用地塞米松注射液的目的：（1）增加眼壓升高的幅度及延長眼壓升高的時間；（2）減輕前房的炎癥反應。

總之，本模型具有可使大鼠眼壓緩慢穩定升高，高眼壓持續時間長，對角膜影響小，炎癥反應輕，方法簡單，易于操作和控制等優點。是一種很好的慢性高眼壓模型。

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