微波固相合成大豆分離蛋白-乳糖接枝物及其流變特性研究*

石燕，陳智韡，涂宗財，，王 輝，黃小琴，沙小梅，張 璆，李雪

1(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌大學食品科學與工程系，江西南昌，330047)

2(江西師范大學生命科學學院，江西南昌，330022)

流變學是研究物質的流動和變形的科學，它與物質的組織結構有密切關系。通過對食品流變特性的研究，可以了解食品的組成、內部結構和分子形態等，可為產品配方、加工工藝、設備選型及質量檢測等提供理論依據［1-2］。

大豆分離蛋白(SPI)是一種蛋白含量90%以上的商用大豆蛋白產品，營養價值高，功能性良好，價格便宜，資源豐富，作為一種重要的原料廣泛地應用于食品工業中［3］。大豆蛋白的流變性在調整食品的物性方面十分重要，在飲料、湯等流體食品中，蛋白質體系的黏彈性是重要功能性質;另一方面，研究蛋白質流變特性，通過分析樣品粘彈性的改變，推測蛋白質結構的變化［2］。

微波加熱(mircowave heating，MH)是一種安全、高效、節能的熱處理方法，它能保持產品中更多營養成分，并廣泛地應用在食品工業中［4］。微波加熱對糖基化修飾的研究［5-7］已有報道，這些研究大多通過緩沖溶液或液體進行傳導，微波固相加熱糖基化的研究較少［8］。微波輻射用于加熱的機理是微波輻照導致目標分子電偶極子發生旋轉和振動。水分子屬極性分子，介電常數較大，微波輻射優先被水分子吸收，而蛋白質、碳水化合物等的介電常數相對較小，其對微波的吸收能力比水小得多。因此，為了減少由于水分子優先被加熱而導致目標分子間接加熱的影響，本研究采用微波加熱大豆分離蛋白-乳糖固體混合物的方法來合成蛋白質-糖接枝物，并且對接枝物流變特性的變化進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆蛋白:粗蛋白含量65.0%，水分7.0%，谷神生物科技集團有限公司;乳糖，阿拉丁，鄰苯二甲醛(OPA)，Sigma公司;Mark(10～200kDa)，Fermentas公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)，β-巰基乙醇，硼砂，甲醇，硅油，30%聚丙烯酰胺，Tri-HCl(pH 6.8)緩沖溶液，Tri-HCl(pH 8.8)緩沖溶液，4×蛋白質上樣緩沖溶液，NaOH，HCl等均為分析純。

LGJ-1型冷凍干燥機，北京亞泰科隆儀器技術有限公司;電泳儀，美國伯樂BIO-RAD公司;UV-3200型分光光度計，上海美譜達儀器有限分司;Discovery DHR-2型流變儀，美國TA儀器;TGL-10C型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;G80F20CN2L-B8(RO)型微波爐，格蘭仕微波爐電器制造有限分司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPI的制備

大豆蛋白與蒸餾水按質量比1∶10混合，室溫下低速攪拌2h，攪拌過程用1 mol/L NaOH保持pH 8.5?；旌弦航? 000×g離心30 min除去不溶物，上清液用2 mol/L HCl調節pH值至4.5，溶液經5 000×g離心15 min，去除上清液，收集蛋白質凝乳，凝乳經蒸餾水沖洗2～3次后，加入蒸餾水，用1 mol/L NaOH調節溶液pH至7.0，攪拌，待沉淀充分溶解后經8 000×g離心30 min除去不溶物，上清液冷凍干燥［9］。

1.2.2 樣品的制備

稱取等質量的SPI與乳糖置于研缽中研磨，混合均勻后過150目篩，收集篩出物。SPI-乳糖混合物(水分含量為7.2%)在800W微波功率下加熱不同時間(30、60、90、120、150、180 s)，冰水浴結束反應。不同樣品配成50 mL溶液，4℃透析2 d，再將溶液稀釋至100 mL，離心(3 000×g)除去不溶物，取10 mL混合物樣品置于冰箱保存，其余樣品凍干制成干粉。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

采用SDS-PAGE測定大豆分離蛋白和不同微波條件處理 SPI-乳糖接枝物的亞基組成和分子質量［10］。SDS-PAGE采用12%的分離膠和5%的濃縮膠制備而成，電泳前，所有樣品均煮沸6～8 min，進樣量10 μL，恒壓，濃縮膠電壓 50V/板，分離膠 110V/板，考馬斯亮藍R-250染色，7%醋酸脫色。

1.2.4 自由氨基的測定

采用OPA法對蛋白質中自由氨基進行測定，在文獻［11-12］方法的基礎上進行改進:準確稱取40 mg OPA溶解于1 mL的甲醇中，依次加入0.2 g/mL SDS 2.5 mL，0.1 mol/L 的硼砂25 mL 及 100μL β-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容至50 mL?？瞻滓翰患覱PA。測定時，各取空白液、OPA試劑4 mL于試管中，分別注入200 μL樣品溶液，混勻后于35℃反應2 min，340 nm下測其吸光值A340。以賴氨酸作出標準曲線，根據標準曲線計算樣品中自由氨基的含量。

1.2.5 流變學分析

配制濃度為0.1 g/mL的樣品溶液，利用Discovery DHR-2型流變儀測定溶液的流變特性。DHR-2型流變儀，40mm直徑，2°的平行板，間隙為1mm，目標應變(target strain)保持0.5%(此應變在線性黏彈區域內)。所有流變學性質測定均重復2次。

1.2.5.1 頻率掃描分析

取2 mL樣品放置在平行板上，掃描頻率在0.1～10Hz，記錄儲能模量(storage moduli，G＇)和損耗模量(loss moduli，G")的變化［13］，并分析樣品相對黏彈性tanδ(tanδ=G"/G＇)隨頻率的變化情況。加樣前將平板的的溫度調至25℃，實驗時保持溫度不變。

1.2.5.2 動態黏彈性分析

取2 mL樣品放置在平行板上，為了防止水分蒸發，在樣品裸露部位覆蓋一層硅油。測量時，振蕩頻率1Hz。樣品在25℃平衡1 min，隨后溫度以5℃/min的速率從25℃升到95℃，并在95℃保持10 min。再以5℃/min的速率從95℃下降到25℃［14］。記錄此過程樣品的G＇隨時間的變化。

2 結果與討論

2.1 SDS-PAGE

圖1為SPI和800W不同時間微波加熱SPI-乳糖接枝物電泳圖。由圖1可知，微波加熱時間較短(0、30 s)時，電泳條帶變化不明顯，隨微波時間延長，SPI-乳糖接枝物的條帶向上移動，這表明蛋白分子質量增加。蛋白質與糖反應時，蛋白中的自由氨基和糖的還原性末端共價結合和蛋白分子之間發生聚集［15-16］，導致SPI-乳糖共聚物分子質量增加。當微波處理時間達到90 s后，隨處理時間增加，大豆球蛋白(11S)中的堿性亞基B變得越來越模糊，這可能是堿性亞基B最不穩定，最易發生聚合過度加熱會使蛋白質中小分子基團發生聚集;微波加熱后，電泳圖譜中分子質量在30～70kDa之間出現了新條帶，這些亞基可能是由于蛋白-蛋白/蛋白-糖形成新的聚合物［13］。

圖1 SPI和MH不同時間SPI-乳糖接枝物電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE profile of SPI and SPI-lactose graft under different MH time

2.2 自由氨基含量變化

糖基化過程中，蛋白中伯胺基基團呈現出高的活性，因此，糖化的自由氨基數量可以作為評價糖基化反應程度的標準［8］。圖2為800W微波不同時間接枝物自由氨基含量的變化圖，由圖2可知，隨微波時間的延長，SPI中自由氨基含量明顯減少。因為在同功率下，微波時間越長，溫度越高，高溫導致大豆蛋白降解，變性，并重新發生聚集，變性的蛋白質與糖的還原性末端發生羰氨縮合反應，這與SDS-PAGE結論一致。同時，當處理時間超過150 s時，樣品明顯逐漸變黑，可能是高溫導致樣品發生炭化。

圖2 MH不同時間SPI-乳糖接枝物自由氨基含量的變化Fig.2 Changes in free amino group content of SPI-lactose graft under different MH time

2.3 頻率掃描分析

由圖3可見，原樣SPI和經微波糖基化處理后的SPI溶液的G＇和G"均隨頻率的增大而升高，樣品黏彈性均有所增強;圖4可知，SPI-乳糖接枝物溶液tanδ比原樣SPI小，這表明未處理的SPI更具有黏性，而經過微波糖基化后SPI樣品呈現出更大的彈性。SPI經微波糖基化處理后，會增強SPI分子間/SPI和乳糖分子間相互作用，從而增強SPI分子間非共價鍵(氫鍵)和 SPI-糖分子間的共價結合［3］，因而 SPI-乳糖接枝物彈性增強。

圖3 SPI和MH 120 s SPI-乳糖接枝物G＇和G"隨頻率變化圖Fig.3 G＇and G"as a function of oscillation frequency of SPI and SPI-Lactose graft after after MH 120 s

2.4 動態黏彈性分析

圖4 SPI和MH 120 s SPI-乳糖接枝物相對黏彈性(tanδ)隨頻度變化圖Fig.4 tanδ as a function of oscillation frequency of SPI and SPI-Lactose graft MH 120 s

由圖5可知，熱循環處理過程中，原樣SPI溶液G＇在升溫和恒溫無明顯變化，在降溫階段顯著增加;而經微波糖化處理后的樣品G＇隨溫度變化不明顯。圖5局部放大圖所示，在升溫階段原樣和微波糖化后的樣品G＇均略有下降;恒溫階段原樣G＇略有升高，微波糖化后G＇略有下降;降溫階段兩者G＇均增加，并且原樣增加更顯著。原因可能是，在升溫階段，隨溫度的升高，樣品中的氫鍵穩定性降低［17］，氫鍵的斷裂將會導致G＇減少。在此階段，經微波處理后的接枝物樣品G＇較原樣SPI大，可能是因為經過微波糖化處理后存在多肽鏈間或/和多肽與糖分子間的相互作用，因而SPI-乳糖接枝物彈性增大;在95℃恒溫階段，原樣SPI溶液G＇隨時間的延長有所提高，而SPI-乳糖接枝物溶液G＇略有下降，且SPI溶液G＇較大?？赡苁怯捎跍囟壬邥r，蛋白溶液疏水作用更穩定，蛋白溶液G＇增強。而SPI經微波糖基化作用后可能會減弱疏水作用或減少疏水基團，改性后的蛋白質在熱變性時將會抑制較遠的區域形成疏水作用。SPI經微波糖化減弱疏水作用與溶液溫度升高穩定疏水作用共同影響導致改性后溶液G＇略有下降;在降溫階段，G＇均增加，原樣SPI溶液增加更顯著，在熱循環結束階段，原樣SPI溶液G＇最大?？赡苁且驗闇囟冉档?，氫鍵的穩定性增強，SPI經微波糖基化修飾后，蛋白質發生變性，導致熱循環過程中降低了形成氫鍵的能力［13］。

圖5 SPI和MH 120 s SPI-乳糖接枝物隨時間動態模量的變化Fig.5 Dynamic moduli as a function of time of SPI and SPI-Lactose graft after MH 120 s

3 結論

綜上分析，800W微波處理條件下，SPI與乳糖發生糖基化反應，并隨微波時間的延長，蛋白質的分子質量逐漸增加，且在30～70 kDa出現了新條帶，在加熱處理90 s后，11 s中的B條帶變淡甚至消失;隨著微波處理時間的延長，SPI中自由氨基含量減少;同時，樣品的流變性質也發生了變化，SPI-乳糖接枝物相對黏彈性(tanδ)降低 ，呈現出更大的彈性，表明蛋白質分子間及蛋白-糖分子間相互作用增強。熱循環處理時，糖基化SPI溶液G＇隨溫度變化不明顯，而原樣SPI溶液G＇在降溫階段明顯增大，可為具有熱加工穩定性的新型大豆分離蛋白的研發提供新途徑。

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