張雪梅,騫秀芳
七葉皂苷鈉對腦缺血再灌注損傷大鼠炎性細胞因子的影響
張雪梅1,騫秀芳2
目的 觀察七葉皂苷鈉對腦缺血再灌注(CI/R)損傷大鼠腦組織中炎性細胞因子的影響,探討其作用機制。方法 采用四血管阻塞10 min的方法建立CI/R大鼠模型,并進行12 h再灌注,試驗分為假手術組、模型組及七葉皂苷鈉高、中、低劑量組(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg),術前3 d開始腹腔注射給藥,每天1次,術后1 h給藥1次。再灌注12 h后,ELISA法檢測腦勻漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平。結果 七葉皂苷鈉高、中劑量可顯著降低CI/R損傷大鼠的神經行為學評分,與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。七葉皂苷鈉各劑量均能降低CI/R損傷大鼠腦組織的TNF-α水平,高、中劑量可明顯降低腦組織IL-1β的表達水平,與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 七葉皂苷鈉預處理對CI/R損傷大鼠的腦保護作用可能與其減少炎性細胞因子的過度釋放有關。
腦缺血再灌注損傷; 七葉皂苷鈉;腫瘤壞死因子-α;白介素-1β
腦缺血再灌注(CI/R)損傷約占腦血管損傷原因的60%,防治由CI/R引起的腦血管損傷具有重要的臨床意義[1]。近年來對CI/R損傷的研究取得了較大進展,但迄今臨床上仍缺乏理想的治療藥物。七葉皂苷鈉(Sodium aescinate)是由七葉樹果實娑羅子中提取的三萜皂苷鈉鹽。研究表明,七葉皂苷鈉具有抗炎、抗滲出、消水腫以及改善血液循環等作用[2-3]。據報道,七葉皂苷鈉對CI/R損傷具有確切的保護作用[4],然其作用機制仍不清楚。本研究探討七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠炎性細胞因子的影響,為其臨床應用提供實驗依據。
1.1 動物 清潔級SD大鼠,雌雄各半,體重240 g~280 g,由河北醫科大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(冀)2008-1-003。動物分籠飼養,適應性喂養1周后進行試驗。
1.2 藥品和試劑 注射用七葉皂苷鈉,購自北京四環科寶制藥有限公司。大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。其余試劑均為分析純。
1.3 主要儀器 光學顯微鏡,日本奧林巴斯公司產品;電子勻漿機,寧波新芝生物科技股份有限公司產品;高速冷凍離心機,中國科大創新股份有限公司產品;紫外分光光度計,日本島津公司。
1.4 CI/R損傷大鼠模型的制備 采用四血管阻塞法建立全腦缺血再灌注動物模型[5]。取SD大鼠,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,頸中切口,分離第一頸椎雙側的橫突孔,電凝雙側椎動脈并分別用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈,10 min后恢復血流灌注,常規縫合頸部切口,再灌注12 h。造模成功標準:夾閉頸總動脈后30 s~60 s內動物昏迷,睫毛反射消失,瞳孔放大,眼球變白,松開動脈夾后20 s~30 s,眼球恢復紅色,意識恢復,并可以活動。剔除術后出現意外的大鼠,如誘發癲癇、肢體癱瘓、意識障礙、死亡等,并予以補齊。
1.5 分組和給藥 取成模大鼠40只,隨機分為:模型組,七葉皂苷鈉低、中、高劑量組(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg),每組10只。另取10只大鼠,不電凝雙側椎動脈,也不夾閉雙側頸總動脈,其余操作同成模大鼠,作為假手術組。術前3 d各組開始腹腔注射給藥,均按10 mL/kg每天給藥1次,術后1 h給藥1次,假手術組和模型組按等體積給予生理鹽水。
1.6 指標檢測
1.6.1 神經行為學評分 再灌注10 h后,按文獻方法對各組大鼠進行神經行為學評分[6],包括運動、感覺、反射以及平衡試驗,最低0分,最高18分,1分~6分為輕度損害,7分~12分為中度損害,13分~18分為重度損害。
1.6.2 腦勻漿TNF-α和IL-1β的檢測 再灌注12 h后,各組動物斷頭,取腦部,在冰浴生理鹽水中漂洗除血,濾紙拭干,稱重,電動勻漿機研磨,加冰浴生理鹽水制成10%腦勻漿,冷凍離心機中5 000 r/min離心10 min,取上清液,采用ELISA法測定TNF-α和IL-1β的表達水平,操作按試劑盒說明書進行。
2.1 七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠神經行為學評分的影響 假手術組評分為0,不納入統計學比較。模型組評分為(7.04±1.19)分,七葉皂苷鈉高、中劑量可分別降低神經行為學評分為(6.24±0.95)分、(6.29±0.87)分,與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。
2.2 七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β水平的影響 模型組大鼠腦組織勻漿中TNF-α和IL-1β水平均顯著高于假手術組(P< 0.01)。七葉皂苷鈉各劑量均能降低CI/R損傷大鼠腦組織的TNF-α水平,與模型組比較差異有統計學意義(P< 0.05)。七葉皂苷鈉高、中劑量均明顯降低CI/R損傷大鼠腦組織IL-1β的表達水平(P< 0.05),與模型組比較差異有統計學意義(P< 0.05)。詳見表1。
表1 七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠TNF-α和IL-1β的影響(±s) μg/(g·Pro)
近年來,藥物預處理是防治CI/R損傷提出的新理念,通過藥物預處理阻斷神經元損傷的病理生理環節,增加機體內源性保護物質,在CI/R損傷的防治中具有重要意義[7]。本研究采用術前3 d開始給藥的預處理方式,觀察七葉皂苷鈉對CI/R損傷大鼠的腦保護作用,結果顯示七葉皂苷鈉各劑量明顯降低了CI/R損傷大鼠的神經行為學評分,說明七葉皂苷鈉預處理能減輕CI/R損傷的神經癥狀,具有一定的神經保護作用。急性炎癥反應是CI/R中引發繼發性腦損傷的主要原因之一[8]。TNF-α和IL-1β是機體炎癥反應和免疫應答的重要細胞因子,CI/R發生時由神經元、神經膠質細胞、血管內皮細胞和血管周圍的炎性細胞分泌產生,過度表達的TNF-α和IL-1β可觸發炎癥反應,啟動多種介質的級聯反應,加重腦組織損害[9-10]。陳素輝等[11]研究表明,CI/R大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的表達在再灌注12 h~144 h后均有所升高,且顯著高于假手術組和正常組。因此,抑制炎癥介質的過度產生,對于改善CI/R損傷有著重要意義。
本研究結果顯示,CI/R損傷大鼠在再灌注12 h后腦組織中TNF-α和IL-1β的表達水平有顯著升高,提示炎性因子的釋放參與了CI/R損傷的病理過程,這與文獻報道[9-11]的結果一致。七葉皂苷鈉各劑量均能下調CI/R損傷大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β的表達,并能緩解神經行為學癥狀,提示七葉皂苷鈉的作用機制可能是通過抑制炎癥介質如TNF-α和IL-1β的表達,從而減輕炎癥級聯反應,實現對CI/R損傷的腦保護作用。
七葉皂苷鈉預處理對CI/R損傷大鼠的保護作用是通過下調腦組織中TNF-α和IL-1β等炎癥因子的表達、減輕腦組織的炎癥反應等途徑實現的。
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(本文編輯 王雅潔)
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Influence of Sodium Aescinate on Inflammatory Cytokines in Rats with Cerebral Ischemia/reperfusion Injury
Zhang Xuemei,Qian Xiufang Beijing Armed Police Forces Hospital, Beijing 100027,China
Corresponding Author:Qian Xiufang(The Second Hospital of Beijing Armed Police Forces, Beijing 100027,China)
Objective To investigate the effect of sodium aescinate (SA) on inflammatory cytokines in rats with cerebral ischemia/reperfusion (CI/R) injury.Methods Rat model of CI/R was prepared by four-vessel occlusion for 10 min followed by 12-hour reperfusion.Rats were then randomly divided into 5 groups (n=10),namely sham group, model group,SA high,medium and low dose groups (10,20 and 40 mg/kg).Drugs were i.p.administered once a day for 3 days before the operation and once 1 hour after the operation,respectively.The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β in brain tissue homogenate were measured by ELISA after 12-hour reperfusion.Resluts The neurological behavior scores in SA high dose group and SA medium dose group were lower than that in model group(P<0.05).The levels of brain TNF-αin SA groups were significantly lower than that in model group (P<0.05).The levels of brain IL-1β in SA high dose group and SA medium dose group were lower than that in model group(P<0.05). Conclusion SA pretreatment can inhibit inflammatory cytokines in brain tissue in rats with CI/R injury.
sodium aescinate;cerebral ischemia/reperfusion injury; tumor necrosis factor-α;interleukin-1β
1.武警北京總隊醫院(北京 100027);2.武警北京總隊第二醫院
騫秀芳,E-mail:158130707@qq.com
R743 R285
A
10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.009
1672-1349(2015)17-1943-03
2015-02-26)