云南野生楊梅快繁體系的建立

孔 梅，藍增全*，吳 田

（西南林業大學a環境科學與工程學院，b園林學院，云南昆明 650224）

云南野生楊梅快繁體系的建立

孔 梅a，藍增全a*，吳 田b*

（西南林業大學a環境科學與工程學院，b園林學院，云南昆明 650224）

以云南野生楊梅種子為材料，在MS培養基中添加不同濃度及配比的激素，研究楊梅無菌快繁的技術體系。試驗結果表明，用20%的次氯酸鈉處理種子，污染率較低，為11.11%；MS+0.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA+6 mg·L-1PVP的培養基有利于芽的增殖，叢生芽最多；MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA+6 mg·L-1PVP的培養基有利于莖節的生長；1.5 g·L-1的活性炭對楊梅無菌苗的防褐化效果最好，褐化率僅為32%；MS+2.0 mg·L-1IBA的培養基有利于誘導生根，生根率達66.67%。

楊梅；種子；褐化；快速繁殖

楊梅可用實生、壓條和嫁接方式進行繁殖，目前主要采取嫁接方式進行繁殖［5］，但是嫁接存活率低，周期長，效率低，難以滿足大規模的生產化需求［6-7］，因此，建立楊梅快速繁殖技術體系具有較高的經濟價值和現實意義。云南野生楊梅即矮楊梅，其Vc含量高于栽培種，含酸量也高于栽培種，具有很高的開發價值。本研究以云南野生楊梅為材料，研究其無菌快繁技術體系，希望為楊梅的大規模育苗提供科學依據和切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

楊梅種子采自云南省曲靖市會澤縣礦山鎮水子樹村大包山，地理坐標103°18′E，26°25′N，挑選成熟飽滿種子為材料。

1.2 處理設計

1.2.1 種子的發芽處理

用冷水浸種48 h后，去殼放入有濾紙的培養皿中待用。在無菌條件下，將濃硫酸預處理的種子用不同濃度的次氯酸鈉（0%，10%，20%，25%）浸泡4 min，再用75%的酒精浸泡30 s，最后用無菌水清洗3次，接種于MS培養基上。30 d后統計其污染率，污染率/%=污染種子數/接種種子總數×100。同一處理共3瓶，設3次重復試驗。

1.2.2 楊梅無菌苗增殖培養基篩選

孔子說：“知之者不如好之者，好之者不如樂之者?！睈垡蛩固褂终f：“興趣是最好的老師?！边@要求老師在導入新課時，精心設計問題情景，激發學生的學習興趣和欲望。讓學生在輕松愉快的學習氛圍中積極主動學習，教師引導學生在精心設計的問題情景中積極探索，體驗每一步求和過程，感受成功喜悅，進一步激發思維創新。

待幼苗長至3～4 cm時，在無菌條件下，切下幼苗帶腋芽的莖段，分別接種于添加不同濃度的6-BA和NAA的培養基上進行培養，共設計16個組合，每瓶接種4～5個外植體，每組5瓶，60 d后統計并記錄無菌苗增殖情況以及長勢。

1.2.3 活性炭處理

向篩選出的最佳培養基中添加活性炭，使培養基中活性炭的濃度分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0 g·L-1，培養45 d以后，觀察植株褐化及生長情況，并統計褐化率，褐化率/%=褐化苗數/接種苗數×100。共設計5個組合，每個組合3次重復試驗。

1.2.4 根的誘導

向MS培養基中分別添加不同濃度的IBA，NAA和IAA，誘導無菌苗生根。共設計14個組合，每組5瓶，每瓶5～6株外植體，30 d后統計生根率，生根率/%=（生根株數/接種株數）×100。

2 結果與分析

2.1 不同濃度次氯酸鈉處理對楊梅種子發芽的影響

不同濃度次氯酸鈉處理對楊梅種子污染率的影響不同，由表1可知，次氯酸鈉濃度為20%時，污染率最低，為11.11%。因此，楊梅種子發芽中，次氯酸鈉最佳消毒濃度為20%。

表1 不同濃度次氯酸鈉處理對楊梅種子發芽的影響

2.2 不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響

不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響不同，詳見表2。當6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1時，植株莖節較細，無菌苗長勢良好，叢生芽較多，為20個，芽長為3 cm，株高為5 cm（圖1中A）。當6-BA濃度為2.0 mg· L-1、NAA的濃度為0.2 mg·L-1時，叢生芽較少，僅有10個，芽長為2 cm，株高為8 cm，葉片較小，節間較長，莖節粗，無菌苗長勢良好（圖1中B）。因此，綜合考慮，誘導楊梅無菌苗芽增殖的最優培養基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg· L-1NAA+6 mg·L-1PVP；誘導楊梅無菌苗莖節增高增長的最優培養基為MS+2.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA+6 mg·L-1PVP。

表2 不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響

圖1 不同激素配比對楊梅無菌苗增殖的影響

2.3 不同濃度活性炭對無菌苗褐化與生長的影響

不同濃度活性炭對無菌苗褐化以及生長的影響不同（表3）。當活性炭濃度為1.5 g·L-1時，無菌苗褐化率最低，為32%；當濃度為2 g·L-1時，褐化率又升高至40%。說明活性炭濃度為1.5 g· L-1時，抑制楊梅無菌苗褐化效果最好。

不同濃度的活性炭對外植體生長的影響也不同，活性炭濃度為0.5 g·L-1時，植株叢生芽少，僅有3個，株高為8 cm，莖節長，葉片較小且偏黃，植株較纖細，長勢較差；活性炭濃度為1，1.5，2.0 g·L-1時，植株叢生芽多，植株較矮小，葉片較大，長勢較好，其中活性炭濃度為1.5 g· L-1時，葉片最濃郁茂盛，植株高，前20 d植株長勢較好，但后期枯葉較多。

由此可見，濃度為1.5 g·L-1的活性炭不僅可以有效抑制楊梅無菌苗褐化，還能促進植株生長。

2.4 不同激素配比對無菌苗生根誘導的影響

楊梅無菌苗植株纖細，生根較難，不同激素配比對根誘導的影響各不相同。楊梅無菌苗生根較慢，20 d才開始生根，30 d后統計生根率。結果（表4）表明，MS+2.0 mg·L-1IBA培養基中的無菌苗生根率較高，達66.67%，根長且粗壯，長勢較好；MS+1.5 mg·L-1NAA培養基中的無菌苗生根率相對較高，為21.82%，根粗，無菌苗長勢好；MS+1.5 mg·L-1IAA培養基中無菌苗生根率較低，為8.93%；培養基中同時添加IBA，NAA和IAA時，無菌苗生根率為47.83%，根粗，無菌苗長勢弱。

綜上所述，IBA對云南野生楊梅無菌苗誘導生根效果比IAA和NAA好，且單激素比激素組合生根率更高。

表3 不同濃度活性炭對無菌苗褐化以及無菌苗生長的影響

表4 不同激素配比對無菌苗生根誘導的影響

3 小結與討論

利用組織培養進行楊梅種苗繁殖，能夠在較短時間內獲得大量優質健康種苗，為工廠化繁育種苗、降低生產成本以及保存品種優良特性等提供了技術支持。本研究建立了楊梅高效組培再生體系，繁殖系數高。本研究表明，野生楊梅種子發芽的最佳次氯酸鈉消毒濃度是20%，污染率為11.11%；誘導楊梅無菌苗芽增殖的最優培養基為MS+ 0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+6 mg·L-1PVP，誘導楊梅無菌苗莖節生長的最優培養基為MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+6 mg· L-1PVP；能有效抑制無菌苗褐化的活性炭濃度為1.5 g·L-1，褐化率可降至32%；無菌苗最適生根培養基為MS+2.0 mg·L-1IBA，生根后植株生長正常，葉片舒展。

目前，關于楊梅組織培養的研究報道還比較少，楊梅屬于木本植物，許多木本植物組織培養過程中存在著難以解決的外植體褐變［8］、試管苗玻璃化［9］和生根難［10］等問題。褐化與菌類污染和玻璃化現象并稱為植物組織培養的三大難題［11-13］。木本植物含酚類物質，當外植體被切割后，切口附近細胞受到傷害，酚類化合物和多酚氧化物向外流出，酚類化合物被氧化成褐色的醌類物質和水，醌類物質又在酪氨酸酶的作用下，使外植體的蛋白質聚合，導致培養基褐變，影響外植體的正常生長［14］。李師翁等［15］在沙棘嫩莖的愈傷組織培養中發現，及時給試驗材料轉瓶、更換新鮮培養基（周期不超過4周），可有效降低愈傷組織的褐變，但轉瓶次數不宜太多，一般2～3次為宜。在本研究中，楊梅外植體褐化情況比較嚴重，培養基中添加了PVP和不同濃度的活性炭，褐化情況得到緩解，但是仍有部分外植體褐化，要完全消除褐化的影響，還需進一步試驗研究。此外，試驗中還發現，不同濃度的活性炭對無菌苗的增殖以及生長也有一定的影響，但是之前未見報道，有待進一步研究證實。

本試驗中，誘導楊梅無菌苗芽增殖的最優培養基和誘導楊梅無菌苗莖節增高增長的最優培養基分別是MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+ 6 mg·L-1PVP和MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA+6 mg·L-1PVP，所用激素的濃度與前人研究結果有所差異［16］，這可能是因為所用的起始材料品種不同、基因不同、生理狀態不同等所致，有待進一步研究證實。此外，在根系誘導過程中，由于培養基成分、培養環境、激素和激素濃度等各種因素，會引起的組培苗失活，葉片頂端或整株黃化［17］，本試驗中根系誘導50 d左右，組培苗出現黃化及枯死現象，此時需要及時轉瓶，將無菌幼苗轉接到新鮮的培養基上，才能保證植株的營養吸收及正常生長。

在木本植物器官發生過程中，細胞分裂素和生長素對芽的誘導和生長發育均起著重要作用，誘導不定芽的形成時，細胞分裂素用量一般高于生長素的用量或只用細胞分裂素［18-20］；而誘導不定根時，只用生長素或配合使用較低濃度的細胞分裂素［21-22］。試驗中對比了不同濃度不同激素對外植體增殖及生長的影響，篩選出了促芽增殖和促莖節生長以及誘導生根的最佳培養基，這為后續的楊梅植株離體再生以及遺傳轉化試驗奠定了一定的基礎，在生產上也可按條件所需添加不同的激素濃度。

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（責任編輯：侯春曉）

S 667.6

：A

：0528-9017（2015）10-1557-04

文獻著錄格式：孔梅，藍增全，吳田.云南野生楊梅快繁體系的建立［J］.浙江農業科學，2015，56（10）：1557-1560.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151008

2015-04-30

國家星火計劃諾麗良種的示范與推廣（2014GA830017）；國家星火計劃金花茶種苗繁育與茶膏加工技術的示范推廣（2014GA830016）

孔 梅（1990-），女，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向為森林生態學。E-mail：1229313040@qq.com。

藍增全，教授，研究方向為植物生態學。E-mail：km lanzengquan@gmail.com；吳 田，副教授，研究方向為植物生物技術。E-mail：2351417655@qq.com。