下一代測序技術在畜禽轉錄組研究中的應用

王樂樂，張燕軍，李曉燕，蘇 蕊，王瑞軍，王志新，李金泉,2

(1 內蒙古農業大學 動物科學學院，內蒙古 呼和浩特010018；2 內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古 呼和浩特010018)

下一代測序技術在畜禽轉錄組研究中的應用

王樂樂1，張燕軍1，李曉燕1，蘇 蕊1，王瑞軍1，王志新1，李金泉1,2

(1 內蒙古農業大學 動物科學學院，內蒙古 呼和浩特010018；2 內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古 呼和浩特010018)

下一代測序技術憑借其高通量的特點成為現代生命科學研究的重要工具之一。轉錄組學是功能基因組學研究的重要內容，畜禽轉錄組學的研究是國內外生命科學研究的熱點內容。文章綜述了下一代測序技術的原理及特點，轉錄組學的研究概要，重點介紹了下一代測序技術在畜禽轉錄組研究中的應用進展，最后對下一代測序技術在生命科學研究中存在的問題和今后的發展方向進行了展望。

下一代測序技術；畜禽；RNA測序；轉錄組學

下一代測序技術 (Next generation sequencing，NGS) 又被稱為第二代測序技術(Next-generation sequencing) 或者高通量測序技術，是利用高通量測序技術進行大規模的DNA 或RNA 測序，以快速準確地獲得基因組編碼序列，在各個領域應用廣泛[1-2]，454測序、Illumina (Solexa)測序和SOLiD測序是先后出現的下一代測序技術。下一代測序技術的出現是基因測序發展歷程的一個里程碑，為深入探究基因、基因組的功能提供了前所未有的機遇。本文就下一代測序技術的原理和特點，轉錄組學的研究概要，及下一代測序技術在畜禽轉錄組研究中的應用進行如下綜述。

1 下一代測序技術的原理和特點

454測序、Illumina(Solexa)測序和SOLiD測序是下一代測序技術中的3種主流測序技術，通常人們所說的高通量測序技術除了上述3種測序技術外，還包括以Helicos 單分子測序技術[3]、SMRT 技術[4-5]和納米孔單分子測序技術[6-7]為代表的第三代測序技術。本文主要介紹454測序、Illumina(Solexa)測序和SOLiD測序技術。

2005年，454公司推出Genome Sequencer 20 (GS20)測序系統，而后454公司被羅氏收購，相繼又推出Genome Sequencer FLX System (GS FLX)和Genome Sequencer FLX Titanium Series reagents(GS FLX Titanium)測序系統。Illumina(Solexa)測序技術最早由Solexa公司研發，利用了“DNA簇”和“可逆性末端總結”專利核心技術，可以進行自動化樣本制備和大規模測序；之后，Illumina收購了Solexa并將測序系統Genome Analyzer升級到HiSeq2000，目前，HiSeq2500 和 MiSeq是Illumina平臺常用的測序系統。 2006年，ABI公司推出的新一代基因序列分析系統SOLiD測序，這種方法在文庫構建和 PCR 擴增方面與 GS FLX系統類似，乳液PCR后以連接反應取代傳統的聚合酶延伸反應，因此又被稱為SOLiD連接酶測序。

454測序、Illumina(Solexa)測序和SOLiD測序的原理都是邊合成邊測序 (Sequencing by Synthesis)，即在合成新DNA互補鏈時只加入1種三磷酸脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)，dNTP是dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP的統稱，如果加入的這種dNTP與模板配對，聚合酶可以將其摻入到引物鏈中并釋放等摩爾數的焦磷酸分子(PPi)，焦磷酸鹽在 ATP 硫酸化酶(ATP-Sulfurylase)催化下轉化成 ATP，ATP在熒光素酶(Luciferase)的催化作用下，將熒光素(luciferin)氧化成氧化熒光素(oxy luciferin)，釋放出熒光信號，根據熒光信號的有無和強度，測定序列。這3種測序方法的工作流程也是相似的，首先3種測序技術都是利用物理方法隨機打斷DNA序列，體外隨機將接頭序列 (adaptor) 添加到單鏈DNA兩端，構建DNA片段文庫；其次，通過橋式PCR或乳化PCR實現DNA片段擴增；最后，通過交替重復的酶促生化反應和熒光標簽圖像檢測步驟完成測序[8]。但這3種測序技術涉及的PCR擴增方式不同、讀長和通量也不同，導致其具有不同的特點和應用方向(表1)。

454測序序列讀長最長，在判斷連續單堿基重復區時準確度不高，且通量低，費用高，這限制了該測序平臺的市場化普及，常應用在對未知基因組進行從頭測序、獲得新基因的宏基因組學(metagenomics)及研究微生物多樣性等領域。Illumina/Solexa 測序的序列讀長相對454測序較短，費用也相對低，適合基因組重測序。SOLiD 測序讀數最短，每個堿基讀取2次，準確率高，而且由于其雙堿基編碼和校正系統的原理與重測序相似，適用于具有高質量參考基因組序列物種的重測序和SNP檢測等。

表1 不同測序技術的特點Table 1 Features of different sequencing techniques

3種測序技術無需進行電泳，操作方便，節約成本，可以在芯片上進行。單次反應可以分析數以百萬計的樣品，很大程度上節省了試驗的時間和成本。盡管在對未知基因組進行從頭測序(De novo sequencing)時仍需傳統測序方法的協助，但這并不影響這3種測序技術在DNA測序[9-11]、單細胞測序[12-13]、表觀遺傳學[14-17]和RNA測序[18-26]等方面的應用。RNA測序即轉錄組測序，是指利用高通量測序技術對組織或細胞中所有的mRNA反轉錄成的cDNA進行測序，全面快速地獲得某一物種特定組織在某一狀態下的所有轉錄本。

2 轉錄組學的研究概要

近年來，隨著轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等組學研究的出現和迅速發展，生命科學研究進入了后基因組時代。轉錄組學是功能基因組學研究的重要內容，率先出現且應用比較廣泛，在研究細胞生理活動規律、揭示基因表達與生命現象之間的內在聯系等方面發揮著越來越重要的作用[27]。轉錄組反映的是生物個體在特定器官、組織或某一特定發育、生理階段細胞中所有RNA表達水平的數據，包括編碼蛋白質的 mRNA 和各種非編碼的RNA(ncRNA)，如microRNA、lncRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA等。它將基因組遺傳信息與生物功能“蛋白質組”聯系起來。相對于真核生物全基因組而言，轉錄組序列不含有內含子和其他的非編碼序列，在序列分析方面具有極高的性價比優勢。

轉錄本身是一個高度動態和可變的過程，而轉錄水平的調控是目前研究最廣泛、最重要的調控方式，隨著非編碼 RNA研究的不斷深入，使得轉錄組研究范圍不斷深化。全基因組mRNA的研究在完善基因結構信息、挖掘新轉錄本和發現新基因等方面發揮著重要作用。microRNA是一種內源性表達、對基因表達進行轉錄后調控的非編碼小RNA，在動物、植物和病毒的多種生命活動中發揮重要作用。lncRNA占ncRNA的80%，由于其序列保守性較低，曾一度被認為是轉錄噪音，隨著研究的不斷深入，證明IncRNA具有明確的生物學功能，既可參與表觀遺傳和可變剪接的過程，也能以細胞微結構原件、小RNA的前體等發揮功能?？勺兗羟惺荝NA水平調控基因表達的機制之一，也是產生蛋白質多樣性的重要機制，是轉錄組學研究的重點內容。隨著下一代高通量測序技術在轉錄組學研究的大量運用，轉錄組學的研究在挖掘單核苷酸多態性(SNP)[18-22]、簡單重復序列(SSR)[23-24]和選擇性剪接(alternative splicing)[25-26]等方面也受到越來越多的關注。

3 下一代測序技術在畜禽轉錄組研究中的應用

近年來，為了更加準確地認識不同水平的轉錄本、可變剪切位點及一些非編碼RNA的調控機理，深刻認識畜禽轉錄水平的調控，轉錄組測序在一些畜禽，如牛、豬、羊和家禽上被廣泛應用。

3.1 在豬轉錄組研究中的應用

迄今為止，豬脂肪組織的轉錄組研究受到比較多的關注，采用RNA-seq對豬脂肪組織進行研究，可以全面洞察豬脂肪組織發育過程mRNA和 miRNA轉錄譜，更好地了解與脂肪性狀相關的基因調控過程?？勺兗羟惺腔虮磉_和蛋白質多樣性的重要機制，近年來被生命科學研究者廣泛關注，Du等[25]采集了113天妊娠杜洛克母豬的胎盤和1周齡歐洲野豬的睪丸，進行RNA-seq和2種繁殖器官中可變剪切的研究，在胎盤和睪丸組織中分別發現5 516和9 061個新的可變剪切富集在與豬繁殖性狀相關的QTL區域，其中豬特有的可變剪切分別為159 和252個，大部分都為非編碼RNA。2013年，李青芝等[18]構建了豬皮下與內臟脂肪組織轉錄組，并進行差異分析，獲得30 532 913～33 479 707個單位置比對的基因組讀段(reads)，鑒定了22 015個轉錄本，覆蓋豬已注解轉錄本的80.2%，同時還發現4 583～4 765個新的轉錄本、936～1 029個可變剪切、16 559個SNPs和1 481個插入/缺失位點(Indels)。王滔[28]以3頭三代內無血緣關系的健康長白母豬為試驗材料，采用illmnina Genome Analyzer II測序平臺對豬背部皮下脂肪、大網膜脂肪和腸系膜脂肪組織進行雙末端高通量測序(2×75 bp)，產生約19.7 Gb (gigabases)的數據，共鑒定出15 004個表達轉錄本，在3種脂肪組織中分別鑒定到4 654、4 583和4 765個新的轉錄本，936、954和1 029個可變剪切，16 559、8 591和5 975個單核苷酸置換，其中2種脂肪組織共表達的轉錄本很少，說明新發現的轉錄本有很強的組織特異性，只在特定的組織中表達。李國喜[29]采用Solexa測序技術檢測了2個階段豬脂肪組織中microRNA的表達譜，在小豬microRNA文庫中鑒定到75.22%的序列與已知miRNA匹配，未被注釋序列占23.26%，在大豬microRNA文庫中鑒定到63.86%的序列與已知miRNA匹配，未被注釋序列占28.1%，并鑒定了脂肪組織發育相關microRNA，對這些miRNA的表達情況和潛在功能進行分析和預測，結果表明，差異表達的miR-103的靶基因明顯富集在與神經系統發育相關的GO terms上。Timoneda等[30]繪制了不同品種豬腎臟microRNA的表達譜，共發現229個microRNA，其中有110個是已報道的豬上存在的microRNA，剩下的119個是直系同源的miRNAs。

3.2 在家禽轉錄組研究中的應用

Hicks等[31]對11日齡的雞胚進行高通量測序，對新的microRNA用Northern Blot進行驗證，發現了4個新的microRNA。2011年，在雌雄雞胚性腺RNA測序時發現984個基因和43個miRNA在兩性性腺中顯著差異表達，并且預測了在雌雄性別分化過程中有顯著差異的53個GO分類和可能參與性別調控的17個代謝途徑[32]。孫桂榮[33]采用Solexa技術對1日齡和36周齡固始雞下丘腦miRNA進行高通量測序和生物信息學分析，結果表明1日齡和36周齡下丘腦的miRNA片段長度主要分布在18～30 nt，但兩組織中miRNA長度分布存在差異，1日齡中長度為22 nt的小RNA占44.35%，22和23 nt的小RNA占總序列的70.72%，但36周齡中表達量最高的是23 nt，占23.06%，22和23 nt的小RNA占總序列的49.43%；對179個差異顯著的miRNA進行靶基因預測，得到了4 362個靶基因，其KEGG和GO結果顯示靶基因大部分參與細胞代謝，或與調控細胞代謝有關。2012年，Li等[34]對白來航雞的骨骼肌組織進行測序，發現lncRNA gga-lnc-0181在骨骼肌組織中高表達，可能預示該lncRNA在雞的骨骼肌發育中發揮著重要作用。2014年，Wang等[35]采用Illumina平臺對感染和未感染禽流感病毒的2個品系的雞進行RNA-Seq，結果發現細胞粘附分子信號通路可能在禽類抵抗AIV病毒時發揮重要作用，這一研究為禽類抗病毒藥物和疫苗的開發提供了新的方向。

3.3 在牛轉錄組研究中的應用

2010年，Angela Cánovas等[36]利用RNA-Seq技術和Illumina平臺對荷斯坦牛的7個牛奶樣本進行了SNP研究，檢測到19 175個基因和100 734 個SNPs。利用RNA-seq在角癌牛上發現了27個可變剪切基因，其中12個為剪切變異體，對新剪切變異體蛋白預測發現，剪切變異能夠導致蛋白質截短，氨基酸的插入和缺失或者形成特異的C-端[26]。Cui等[37]根據乳中蛋白和脂肪含量的不同將4頭荷斯坦奶牛分為極高和極低2個表型組，采用Illumina Hiseq 2000平臺對試驗牛的乳腺上皮組織進行了轉錄組測序，發現了48 967 376～75 572 578個單位置比對，覆蓋了82.25%的已經注釋的轉錄本；31個差異表達的基因，顯著富集在蛋白質代謝、脂肪代謝和乳腺發育等特定的生物學過程中；結合之前的報道，進一步預測影響牛奶中蛋白和脂肪含量的基因可能是TRIB3、SAA、VEGFA、PTHLH和 RPL23A，這一結果為研究牛奶成分提供了一定的分子理論。Billerey等[38]在關于長鏈非編碼RNA(lncRNAs)的研究中，對9頭利木贊牛的肌肉組織進行了轉錄組測序，鑒定了30 548個不同的轉錄本和584 個不同的lincRNAs，在584 個lincRNAs中有418個在9頭試驗牛上都存在；并且發現這些lincRNAs的表達水平顯著低于編碼蛋白基因的表達水平，這一結果和前人的研究一致。蘭道亮等[39]對牦牛卵巢組織進行了RNA-Seq，獲取了26 826 516個高質量讀數， 16 992個牦牛表達基因，同時發現6 321個新的轉錄本；這一研究不但為進一步探析牦牛繁殖性能提供了基礎，也證實了RNA-Seq在完善基因結構、挖掘新轉錄本和新基因方面具有強大的優勢。

3.4 在羊轉錄組中的應用

2012年，Geng等[40]采用HiSeq 2000對絨山羊毛囊發育周期中的皮膚進行Illumina測序，結果在毛囊的生長、衰退和休止期分別檢測到8 487 344，8 142 514 和 7 345 335個有效序列(clean reads)，同時檢測出1 332個差異表達的基因，其中生長期與衰退期之間的差異基因有683個，生長期與休止期有530個，衰退期與休止期有119個；同時發現這些差異表達的基因在毛囊生長發育的相關通路Wnt、Shh、TGF-b和Notch中可能發揮重要的作用。Liu等[41]采用羅氏454測序方法對3只遼寧絨山羊的13個組織進行了轉錄組測序，得到了804 601個高質量讀數，發現有17 356個unigenes富集在6 700個GO聚類，從參與的生物過程、分子功能和細胞組分這3個方面描述了unigenes的屬性，82.51%的unigenes被定位到山羊基因組上，35 551個unigenes匹配到11 438個山羊的編碼蛋白質基因，從所有的unigenes鑒定出了2 781個潛在的簡單重復序列。2013年，Xu等[42]利用Illumina/solexa高通量測序技術檢測了絨山羊皮膚毛囊生長期和休止期的差異表達基因，發現2個時期有7 000個差異表達的轉錄本，KOG分析發現這些轉錄本主要富集在信號轉導、細胞外結構和細胞骨架等生物學過程上，Kegg結果顯示差異基因主要在ECM受體相互作用通路、粘著斑和縫隙連接等通路發揮作用。在對陜北白絨山羊不同時期皮膚樣本的Solexa測序研究中，鑒定出了399個保守的microRNA，其中326個microRNA在毛囊生長期、退行期和休止期都有表達；同時發現了172個新的microRNA，其中在毛囊生長期、退行期和休止期特異性表達的分別有23，29和44個；通過生物信息學發現，23.08%的microRNA的靶基因涉及了278種生物功能，代謝途徑、致癌途徑、MAPK信號通路、內吞作用和粘著斑是5個主要的通路過程[43]。Liu等[44]對藏綿羊生長期、退行期和休止期的毛囊進行測序，發現成熟microRNA 244個，其中204個為保守microRNA，35個為新microRNA，5個被收錄在microRBase中；進一步研究發現microRNA可能通過調控MAPK和Wnt等通路來調控毛囊生長。這些結果為研究山羊毛囊發育的機制提供了新的線索。

已有研究顯示，RNA-seq能有效檢測畜禽轉錄本，在完善基因結構、挖掘新轉錄本和新基因等方面有強大的優勢，同時為研究轉錄水平的調控機制打下了堅實的基礎。

4 前景與展望

下一代測序為發現新基因、研究基因表達、基因功能和遺傳變異提供了方法。目前，454 測序技術的平均測序讀長為400～1 000 bp，較長的讀數意味著在一次測序過程中會有較大范圍的重復片段出現，這樣就可定位出更多的外顯子。Illumina公司開發的HiSeq 2500高通量測序平臺能提供2×150 bp的讀長，適合樣品量較多，測序深度要求高的測序試驗。測序平臺的不斷開發和完善讓測序成本不斷降低，使得轉錄組測序在畜禽育種、群體進化、藥物研發、疾病研究和臨床診斷等方面有著廣闊的應用前景。當然，畜禽轉錄組的研究實施起來也存在一定的困難，如測序得到的生物數據量龐大，個人電腦無法分析；缺乏相應的Software和Database資源；一般實驗人員對于大型分析服務器的適用和維護生疏。另外，測序費用仍相對較貴，一般實驗室難以配置昂貴的測序儀，多數都是與生物公司合作完成一些測序工作，這在一定程度上限制了試驗方案的實施。只有將這些困難克服，用最少花費得到最有價值的信息，下一代測序技術才會擁有更廣闊的前景。目前，新的技術仍處于不斷開發中，技術的進步會推動測序成本不斷降低，相信不久高通量測序將成為一項實驗室常規手段，為今后生命科學研究帶來深刻的變革。

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[42] Xu T,Guo X,Wang H,et al.Differential gene expression analysis between anagen and telogen ofCaprahircusskin based on the de novo assembled transcriptome sequence [J].Gene,2013,520(1):30-38.

[43] Liu G,Liu R,Li Q,et al.Identification of microRNAs in wool follicles during anagen,catagen,and telogen phases in Tibetan sheep [J].PLoS One,2013,8(10):e77801.

[44] Yuan C,Wang X,Geng R,et al.Discovery of cashmere goat (Caprahircus) microRNAs in skin and hair follicles by Solexa sequencing [J].BMC Genomics,2013,14:511.

Application of next generation sequencing techniques in transcriptomics of livestock and poultry

WANG Le-le1,ZHANG Yan-jun1,LI Xiao-yan1,SU Rui1,WANG Rui-jun1,WANG Zhi-xin1,LI Jin-quan1,2

(1CollegeofAnimalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot,InnerMongoliaAutonomousRegion010018,China;2TheKeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproduction,Hohhot,InnerMongoliaAutonomousRegion010018,China)

Next generation sequencing techniques are among the most powerful tools in modern science research,and play a key role in genomic sequencing.Transcriptomics is important in functional genomics,and the transcriptomics of livestock and poultry is now a hotspot of life science at home and abroad.This paper reviews the principles and the characteristics of the next generation high-throughput sequencing techniques and research profiles of transcriptomics with a particular focus on the application in the transcriptomics of livestock and poultry.At last,the existing problems and future directions are analyzed and prospected.

next generation sequencing；livestock and poultry；RNA-Seq；transcriptomics

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.003

2014-07-16

國家高技術研究發展計劃 (“863”計劃)項目( 2013AA100506)；國家自然科學基金項目(31260539)；國家農業部現代農業產業技術體系項目(CARS-40-05)

王樂樂(1985-)，女，河南駐馬店人，在讀博士，主要從事絨山羊分子遺傳育種研究。E-mail：leleruwu@sina.cn

李金泉(1957-)，男，內蒙古呼和浩特人，教授，博士，博士生導師，主要從事絨山羊遺傳育種研究。 E-mail:lijinquan_nd@126.com

Q75；S8

A

1671-9387(2015)09-0017-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.006.html