43份菊芋種質資源遺傳多樣性的ISSR分析

趙孟良，孫雪梅，王麗慧，李 莉

(青海省農林科學院菊芋研發中心 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016)

43份菊芋種質資源遺傳多樣性的ISSR分析

趙孟良，孫雪梅，王麗慧，李 莉

(青海省農林科學院菊芋研發中心 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016)

【目的】 探明國內外菊芋(HelianthustuberosusL.)資源間的親緣關系遠近及遺傳多樣性?！痉椒ā?以40份國外菊芋資源與3個國內栽培品種為材料，選用14條引物進行ISSR分子標記分析，分析他們的遺傳多樣性，利用POPGENE32軟件計算多態位點比率(PPB)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)、Shannon’s信息指數(I)。采用NTSYS 2.10軟件計算品種間的相似系數，進行聚類分析，并對不同類群的形態學主要特點進行分析?！窘Y果】 采用14條引物對43份菊芋資源進行PCR擴增，共獲得203個標記，其中多態性標記199個，多態性比率為98.0%。采用POPGENE32軟件分析，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數為1.894 8，平均 Nei’s基因多樣性指數為0.467 7，平均 Shannon’s 信息指數為0.659 0。43份菊芋資源間的相似系數為0.443～0.955。聚類結果顯示，供試的43個菊芋資源可聚為2個類群，能很好地將國外菊芋資源與國內品種區分開來。不同類群菊芋的塊莖形態及顏色有明顯差異?！窘Y論】 國內外菊芋資源間遺傳關系較遠，且國外資源間存在豐富的遺傳多樣性。

菊芋；種質資源；ISSR；遺傳多樣性

菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜、鬼子姜，為菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)多年生草本植物，18世紀末從歐洲傳入中國，之后被人們當作蔬菜栽培食用。菊芋具有極強的抗旱、抗寒、耐鹽堿能力，能夠適應惡劣的生長環境。菊芋還具有極大的利用價值，國內眾多單位已經開展了關于菊芋的生物質能源利用[1]、果聚糖代謝調控機理[2]、菊芋秸稈造紙[3]及飼草料加工應用[4]等方面的研究。目前，國內對于菊芋品種的選育主要是采用人工定向的方式，因此豐富的種質資源必將是菊芋育種的先決條件。青海省農林科學院菊芋研發中心歷經十余年的育種研究，已經審定通過了青芋1號、青芋2號、青芋3號3個菊芋品種[5-7]，是目前國內審定品種最多的菊芋研發單位，已收集、保存國內外菊芋資源400余份。

ISSR(Inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年發展起來的一種微衛星基礎上的分子標記，目前已廣泛應用于居群遺傳多樣性分析[8-9]、雜交后代鑒定[10-11]及分子生態學[12]研究中。在菊芋方面，本課題組已成功建立了菊芋ISSR-PCR擴增條件及程序,并篩選出了特異性好的引物，同時利用該技術對國內青芋1號、2號、3號3個菊芋品種進行了快速鑒定[13-14]。因此，ISSR分子標記在菊芋方面的應用已較為成熟，可以利用該技術研究不同來源的菊芋資源遺傳多樣性。

本研究從青海省農林科學院菊芋研發中心種質資源庫中挑選了40份國外菊芋種質資源及國內3個審定菊芋品種為供試材料，利用ISSR技術，對國外與國內菊芋品種的親緣關系及遺傳多樣性進行了分析，旨在為菊芋種質資源的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為40份國外菊芋資源與3個國內審定菊芋品種(表1)，均種植于青海省農林科學院菊芋研發中心資源圃內。于2012-04選取幼嫩菊芋葉片,硅膠干燥后在-20 ℃保存備用。43份菊芋資源分別于2012-10及2013-10采收時按照菊芋觀察記載標準進行統計。

表1 43份菊芋種質資源及來源Table 1 43 Helianthus tuberosus L.and their exporting countries

1.2 方 法

試驗于2012-04-2013-09在青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室內完成。

1.2.1 DNA提取與檢測 菊芋葉片DNA提取及檢測參照文獻[15]的方法進行。

1.2.2 引物篩選及PCR擴增 參照韓睿等[14]的菊芋 ISSR 引物篩選結果，從中選擇擴增條帶清晰、多態性好的14條引物進行PCR反應。引物名稱及序列已在表2中列出。ISSR-PCR反應體系和擴增程序參照趙孟良等[13]的報道進行，PCR反應體系(20 μL)包括：1.5 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.0 UTaqDNA 聚合酶和50 ng模板DNA；PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸75 s，循環40次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 數據統計分析

凝膠圖像用Image Lab 3.0軟件進行分析，電泳圖譜的每條帶(DNA片段)均為1個分子標記(Marker)，代表1個引物的結合位點。根據各分子標記的遷移率及其有無統計所有的二元數據，有帶(顯性)記作1，無帶(隱性)記為0，強帶和弱帶均賦值，根據0，1矩陣建立43個菊芋資源的DNA指紋圖譜。利用POPGENE32軟件計算多態位點比率(PPB)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)、Shannon’s信息指數(I)。用NTSYS 2.10版軟件計算樣品間的相似系數，然后利用SAHN Clustering軟件的算術平均法(Unweighted pair-group method arithmetie average，UPGMA)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 菊芋資源的ISSR分子標記的多態性

由表2可知，14條引物對43份菊芋模板共擴增出位點203個，其中多態性位點199個，多態性位點比率(PPB)達到98.0%，引物847的多態位點比率最低，為91.7%；14條引物擴增的條帶數為9～18條，平均為14.5條，其中擴增條帶數最少的為引物844，只有9條。擴增片段長度大多為300～2 000 bp。引物844的擴增結果見圖1。

表2 基于14條引物的43份菊芋PCR擴增結果Table 2 PCR amplification of 43 Jerusalem artichoke varieties based on 14 primers

注：*Y 代表簡并堿基C 或者 T，R 代表簡并堿基A 或者 G。

Note：Y represents degenerate base C or T，and R represents degenerate base A or G.

由表3可知，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數(Ne)為1.894 8，平均Nei’s 基因多樣性指數為0.467 7，平均 Shannon’s信息指數為0.659 0。各位點遺傳多樣性程度也存在較大差異，Nei’s基因多樣性指數最大值為0.499，最小值為0.430 8。Shannon’s 信息指數最大值為0.693，最小值為0.308。

圖1 引物844對43份菊芋的PCR擴增結果M.DNA Marker DS5000；1～43.分別為表1中的43份菊芋資源；箭頭所示為多態性位點位置Fig.1 PCR amplification of 43 Jerusalem artichoke varieties based on primer 844 M.DNA Marker DS5000；1-43.the 43 of Helianthus tuberosus L.as in Table 1；The position indicated by arrows are polymorphism loci

表3 供試43份菊芋資源的Nei’s基因多樣性指數和Shannon’s信息指數Table 3 Nei’s gene diversity index and Shannon’s index of the tested 43 Jerusalem artichoke resources

續表3 Continued table 3

2.2 基于相似系數的供試菊芋資源ISSR聚類分析

以供試的43份菊芋資源擴增出的203個位點數據為原始矩陣，共獲得903個兩兩不同的遺傳相似系數，其中FA25與FA26的相似系數最大，為0.955，說明這2個菊芋資源親緣關系很近；FA2與青芋2號的相似系數最小，為0.443，說明二者親緣關系較遠。從聚類圖(圖2)可以看出，以0.64為閾值可以將供試菊芋資源分為2大類群。第Ⅰ類群：40份資源，均為國外資源(占所有資源的93.02%)，對其進一步分析，又可將第Ⅰ大類在閾值為0.784處分為7個亞類。第1亞類有30個資源，占第Ⅰ類群的75.0%；第2亞類有3個資源，分別是FA4、FA6和FA12，占第Ⅰ類群的7.5%；第3亞類有2個菊芋資源，分別是FA15和FA20，占第Ⅰ類群的5.0%；第4亞類有2個菊芋資源，分別是FD2和FD5，占第Ⅰ類群的的5.0%；第5亞類有1個菊芋資源，即FA5，占第Ⅰ類群的2.5%；第6亞類有1個菊芋資源，即FA7，占第Ⅰ類群的2.5%；第7亞類有1個菊芋資源，即FA9，占第Ⅰ類群的2.5%。第Ⅱ類群有3個菊芋品種，均為國內審定品種，包括青芋1號、2號、3號3個菊芋品種。

由以上分類可知，國外40份菊芋資源與國內3個菊芋品種之間的親緣關系較遠。同時，聚類圖顯示同一地區的種質資源優先聚在一起，如來自中國的青芋1號、2號、3號聚為一類，體現出一定的地域性。

2.3 不同類群菊芋種質資源的形態學主要特點

在實際生產中，通常是通過觀察對比菊芋全生育期內的植物學性狀，如株高、莖粗、葉形、塊莖形狀、塊莖顏色等來區分不同的菊芋資源，但最常用的最直觀的方法是通過塊莖的形狀及顏色來進行區分。因此本研究主要從塊莖形狀及顏色對菊芋種質資源進行分析。

第1亞類30份菊芋種質資源中塊莖形狀主要有紡錘形、球形、瘤狀3種，其中紡錘形的包括FA1、FA23、FD3、FD6、FD9、FD10、FD13 等7種，球形的包括FA2、FA3、FA8、FA11、FA14、FA17、FA18、FA19、FA25、FA26、FD1、FD4等12種，瘤狀的包括FA10、FA13、FA16、FA21、FA22、FA24、FA27、FD7、FD8、FD11、FD12等 11種；塊莖顏色主要有白色、紅色、紫色、褐色、白褐色5種，其中白色的包括FA1、FA3、FA8、FA10、FA13、FA16、FA17、FA18、FA21、FA22、FA23、FA24、FA25、FA26、FA27、FD4、FD7、FD8、FD12等19種，紅色的包括FA2、FA11、FA14、FD1 等4種，紫色的包括FD3、FD6 2種，褐色的包括FD13 1種，白褐色的包括FA19、FD9、FD10、FD11等 4種。第2亞類3份菊芋資源塊莖形狀：FA4與FA12為紡錘形，FA6為球形；塊莖顏色：FA4為紫紅色，FA6為白褐色，FA12為紅色。第3亞類的2份菊芋資源塊莖形狀：FA15為紡錘形，FA20為球形；塊莖顏色：FA15為白褐色，FA20為紅色。第4亞類中的2份菊芋資源塊莖形狀均為瘤狀，塊莖顏色均為白色。第5亞類中FA5塊莖為紡錘形，顏色為白色。第6亞類中FA7塊莖為棒狀，顏色為紅色。第7亞類中FA9塊莖為紡錘形，顏色為白褐色。

圖2 基于相似系數的43份菊芋資源的UPGMA聚類結果
Fig.2 Similarity coefficient based UPGMA clustering of the 43HelianthustuberosusL.resources

3 討 論

3.1 國外菊芋資源遺傳多樣性分析

豐富的菊芋種質資源是菊芋育種的基礎，而探明親本材料的遺傳多樣性程度和親緣關系的遠近是育種的關鍵[16]。目前，ISSR標記技術已被廣泛應用到種質遺傳多樣性和遺傳差異檢測的研究中[17-18]。本試驗采用ISSR分子標記技術研究了國外40份菊芋資源與國內3個菊芋品種之間的遺傳多樣性及親緣關系。結果表明，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數為1.894 8，平均Nei’s基因多樣性指數為0.467 7，平均Shannon’s 信息指數為0.659 0；43份菊芋資源間的相似系數為0.443～0.955，說明ISSR標記技術完全能夠應用于菊芋資源遺傳多樣性分析研究。

因此，根據本研究的結果，在今后菊芋育種過程中可以利用遺傳距離相對較遠的資源進行雜交，創制新的菊芋種質。此外本研究還發現，來源相同的菊芋資源如FA5、FA7和FA9單獨聚為一類，下一步可以通過增加ISSR引物、優化試驗條件來深入探討這些菊芋資源間的遺傳多樣性[19]。

3.2 菊芋遺傳距離與地理距離的相關性

國外40份菊芋資源與國內的3個菊芋資源間的遺傳距離較國內品種間的遺傳距離大，具有較高的遺傳多樣性，其中部分資源可以作為新的育種材料加以利用。另外，各供試材料在種質遺傳距離與來源地的關系上表現出了很強的相關性，聚類結果顯示，國內與國外菊芋種質資源未聚為一類，說明國外菊芋資源與國內菊芋品種親緣關系較遠。

3.3 菊芋聚類結果與形態學分類結果的差異

對40份國外菊芋資源的聚類分析結果與根據形態性狀進行分類的結果部分吻合，說明二者具有一定的相關性[20]。供試的一部分菊芋資源從形態學上分類不屬于一類，但是在基于ISSR 標記的聚類分析中被劃分到同一類中，例如第Ⅰ大類中的第2亞類FA6與FA12，二者塊莖形狀一致但顏色不同，在基于ISSR標記分析的聚類樹狀圖中二者親緣關系較近并聚在一起，在第1亞類中同樣有類似的情況出現。這一方面說明傳統的形態分類方法不能完全反映出菊芋資源間的親緣關系，必須結合分子標記等其他生物學方法進行完善；另一方面說明可以適當增加ISSR引物做進一步的篩選分析。

本研究首次利用ISSR分子標記技術對來自國外的菊芋群體資源與國內審定的3個菊芋品種進行了親緣關系及遺傳多樣性分析，結果表明，國內與國外菊芋資源間遺傳關系較遠，且國外資源間存在豐富的遺傳多樣性。因此，在今后的育種工作中可以依據遺傳多樣性分析和聚類結果進行親本選擇，避免人力物力資源的浪費，為后續菊芋資源的可持續性開發利用提供科學依據。

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ISSR based genetic diversity of 43HelianthustuberosusL.

ZHAO Meng-liang,SUN Xue-mei,WANG Li-hui，LI Li

(ResearchandDevelopmentCenterofJerusalemArtichoke,QinghaiKeyLaboratoryofVegetableGeneticsandPhysiology,QinghaiAcademyofAgricultureandForestry,Xining,Qinghai810016,China)

【Objective】 This study aimed to clarify genetic relationship and genetic diversity of Jerusalem artichoke resources at home and abroad. 【Method】 A total of 40 foreignHelianthustuberosusL. resources and 3 domestic varieties were used as experimental material,and 14 primers were adopted for ISSR molecular marker analysis to analyze their genetic diversity.POPGENE32 software was used to calculate ratio of polymorphic loci (PPB),effective number of alleles (Ne),Nei’s genetic diversity index (H),and Shannon’s information index (I) while NTSYS 2.10 software was used to calculate similarity coefficient between varieties,conduct clustering analysis,and analyze the morphological characteristics of different groups.【Result】 A total of 203 marks were obtained when using 14 primers to amplify the 43 Jerusalem artichoke resources by PCR amplification.199 polymorphism markers were polymorphic markers with the polymorphism rate of 98.0%.POPGENE32 software analysis showed that averaged effective number of alleles,Nei’s genetic diversity index,and Shannon’s information index,of the 43HelianthustuberosusL.resources were 1.894 8,0.467 7,and 0.659 0,respectively,while NTSYS showed that and the similarity coefficient was 0.443 to 0.955.Clustering analysis showed that 43HelianthustuberosusL.【Conclusion】 The genetic relationship ofHelianthustuberosusL.resources between domestic and abroad was far,and the foreign resources had abundant genetic diversity.

HelianthustuberosusL.;germplasm resources;ISSR;genetic diversity

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.021

2014-03-05

農業部“948”項目(2013-Z72)；青海省科技廳基礎研究項目(2012-H-809)

趙孟良(1986-)，男，河南商丘人，碩士，助理研究員，主要從事菊芋遺傳育種及生理生化研究。 E-mail：zhaomengliang@qhu.edn.cn

李 莉(1959-)，女，江蘇豐縣人，研究員，碩士生導師，主要從事蔬菜遺傳育種及栽培生理研究。 E-mail：yyslili@163.com

S330

A

1671-9387(2015)09-0150-07

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.042.html