柱前衍生RP-HPLC法測定狗尾草種子氨基酸含量

趙 巖，唐國勝，侯瑩瑩，郜玉鋼，王士杰，蔡恩博，張連學

(1 吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2 吉林農業科技學院 中藥學院，吉林 吉林 132101)

柱前衍生RP-HPLC法測定狗尾草種子氨基酸含量

趙 巖1，唐國勝1，侯瑩瑩1，郜玉鋼1，王士杰2，蔡恩博1，張連學1

(1 吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2 吉林農業科技學院 中藥學院，吉林 吉林 132101)

【目的】 采用柱前衍生反相高效液相色譜(RP-HPLC)法檢測狗尾草種子中游離氨基酸和水解氨基酸含量，為闡明其應用價值提供支撐?！痉椒ā?制備狗尾草種子的水解氨基酸樣品溶液和游離氨基酸樣品溶液，以異硫氰酸苯酯和三乙胺進行柱前衍生，建立RP-HPLC法，檢測方法的精密性、穩定性、重復性。利用RP-HPLC法，采用梯度洗脫方法，檢測狗尾草種子中游離氨基酸和水解氨基酸含量?！窘Y果】 21種氨基酸的檢測濃度線性范圍為0.001 9～2.700 0 μmol/mL,相關系數R2均≥0.999 0。21種游離氨基酸的平均加樣回收率在87.50%～100.20%，相對標準偏差(RSD )在0.82%～2.46%；水解氨基酸的平均加樣回收率在91.10%～100.21%，RSD 在0.52%～2.08%。必需氨基酸和半必需氨基酸在狗尾草21種游離氨基酸和水解氨基酸中均含有，但水解后色氨酸、天冬酰胺、組胺酰胺遭到了破壞，含量較低?！窘Y論】 建立的氨基酸測定方法穩定、快速、精密度高、線性范圍寬，適合狗尾草種子中游離氨基酸和水解氨基酸的含量測定。狗尾草種子中含有豐富的游離和水解氨基酸。

狗尾草種子；氨基酸；反相高效液相色譜法；柱前衍生化

狗尾草(Setariaviridis(L.) Beauv.)為禾本科狗尾草屬一年生草本植物，在全球分布廣泛，一直被人們視為害草，而忽略了其藥用價值?！侗静菥V目》、《本草綱目拾遺》等中藥典籍中有記載：狗尾草具有除熱、去濕、消腫、治癰腫、瘡癬、赤眼的功效。賢景春等[1]對狗尾草多酚提取及其抗氧化性進行了研究，但對于狗尾草種子中游離氨基酸及水解氨基酸含量尚未見相關報道。而氨基酸有多種藥理作用，例如：谷氨酸是生物機體內氮代謝的基本氨基酸之一，是動物體內中樞神經系統的一種重要的興奮性神經遞質，與腦蛋白質和糖代謝、促進氧化過程、改善中樞神經系統緊密相關；亮氨酸可作為營養增補劑、調味增香劑，也可配制氨基酸輸液及綜合氨基酸制劑、降血糖劑、植物生長促進劑等。氨基酸水解方法主要有酸水解法、氧化水解法、微波輔助水解法[2-5]等，測定方法主要有氨基酸自動分析儀分析法、高效液相色譜法、細管電泳法、紫外檢測法等[6-10]。柱前衍生高效液相色譜法(RP-HPLC)測定氨基酸具有選擇性高、分析速度快和靈敏度高等優點，在藥物和臨床樣品氨基酸分析中得到了廣泛應用，已成為一種較為理想的氨基酸檢測方法。本試驗利用RP-HPLC檢測了狗尾草種子中的氨基酸含量，以期為狗尾草種子的進一步研究和開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

狗尾草種子采收于吉林農業大學校園內，經該校張連學教授鑒定，陰干，備用。

1.2 儀器與試劑

CXTH-3000高效液相色譜儀(北京創新通恒科技有限公司)；DHG-9140A型恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；2XZ-4型旋片式真空泵(上海博一泵業制造有限公司)；DZF6020真空干燥器(上海恒科學儀器有限公司)；氨基酸水解管(北京康農科技發展有限公司)；PHS-W微機型Ph/mV酸度劑(上海般特儀器有限公司)。甲醇、乙腈，色譜純；異硫氰酸苯酯(PITC)，化學純；21種氨基酸(國藥集團化學試劑有限公司)，分析純。其他試劑均為分析純試劑。

1.3 方 法

1.3.1 試劑的配制 流動相A：精密稱取15 g乙酸鈉，加純凈水溶解，用乙酸調pH為 6.5，加水至1.85 L，加140 mL乙腈，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，即得0.1 mol/L乙酸鈉(pH 6.50)與乙腈體積比為93∶7的流動相A。

流動相B：精密量取乙腈800 mL，水200 mL，混勻，0.45 μm濾膜過濾，即得乙腈與水體積比為 4∶1 的流動相B。

衍生試劑A (即異硫氰酸苯酯試劑貯備液)：取2 mL異硫氰酸苯酯置10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，即得。

衍生試劑B (即三乙胺試劑貯備液)：取2 mL三乙胺置10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，即得。

1.3.2 氨基酸標準溶液的配制 準確稱取天冬氨酸(Asp)16.7 mg、谷氨酸(Glu)18.4 mg、絲氨酸(Ser)13.13 mg、甘氨酸(Gly) 9.38 mg、組氨酸(His)19.39 mg、精氨酸(Arg)21.77 mg、蘇氨酸(Thr)14.90 mg、丙氨酸(Ala)11.13 mg、脯氨酸(Pro)14.39 mg、胱氨酸(Cys-Cys)14.02 mg、半胱氨酸(Cys)15.14 mg、纈氨酸(Val)14.64 mg、甲硫氨酸(Met)18.64 mg、異亮氨酸(Lle)16.39 mg、亮氨酸(Leu)16.39 mg、酪氨酸(Tyr)22.64 mg、苯丙氨酸(Phe)20.64 mg、色氨酸(Trp)25.51 mg、賴氨酸(Lys)18.27 mg、天冬酰胺(Asn)16.70 mg和谷氨酰胺(Gln)18.26 mg，加0.1 mol/L鹽酸超聲溶解，配制胱氨酸濃度為0.625 μmol/mL、其他標樣濃度為1.25 μmol/mL的標準溶液，4 ℃保存。

1.3.3 供試品溶液的制備與衍生 (1)游離氨基酸供試品溶液。 精密稱取狗尾草種子樣品0.5 g，加入體積分數50%乙醇溶液50 mL，超聲提取30 min，用濾紙過濾，濾渣再加入體積分數50%乙醇溶液 30 mL，超聲提取 30 min，過濾，合并2次所得濾液于 80 ℃水浴中揮發至近干，用體積分數50%乙醇溶液定容至10 mL。取1 mL提取液，加入衍生試劑A 和B 各1 mL，于50 ℃水浴中保持 45 min，加入正己烷1 mL萃取，取下層溶液用0.45 μm 濾膜過濾，進行HPLC分析。

(2) 水解氨基酸供試品溶液。 采用酸水解的方法處理狗尾草種子樣品，參考李玉玲等[4]在吹N2狀態下封口的方法，本試驗采用抽真空后充氮氣，保證氮氣充滿水解管，以防止氨基酸氧化的方法進行試驗。具體操作是，精密稱取樣品0.1 g，置于氨基酸水解管中，加入6 mol/L鹽酸10 mL、體積分數1%苯酚1 mL，重復抽真空充氮氣3次，置于110 ℃烘箱中水解24 h；水解后置于80 ℃水浴揮發干，加入2 mL水，重復該操作2次，盡可能多地揮發掉鹽酸；加入2 mL水，超聲1 min使溶解并定容于10 mL容量瓶中，吸取1 mL提取液，加入衍生試劑A 和B 各1 mL，于50 ℃水浴中保持45 min，加入正己烷1 mL萃取，取下層溶液用0.45 μm濾膜過濾，進行HPLC分析。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：Ultimate Amino Acid氨基酸色譜專用柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫：36 ℃，進樣量：10 μL。流動相梯度為:0 min， A；11 min，6.5%B+93.5%A；13.9 min，11%B+89%A；17 min，13.4%B+86.6%A；29 min，30%B+70%A；32 min，70%B+30%A；35 min，B；42 min， B；45 min，A；60 min，A。

1.4 HPLC方法考察

1.4.1 線性關系考察 分別取氨基酸標準溶液 0.01,0.05,0.10,0.50,1.00 mL，按1.3.3節方法衍生后進行HPLC。以各氨基酸峰面積為縱坐標(y)，氨基酸濃度(μmol/mL)為橫坐標(x)，做線性回歸。

1.4.2 精密度試驗 取混合氨基酸標準溶液1 mL，按1.3.3節方法衍生后進行HPLC分析，連續進樣5 次，測定峰面積，考察方法的精密度。

1.4.3 穩定性試驗 取1.3.3節供試品溶液1 mL，分別于0，1，2，4，6，8，12 h 進行HPLC分析，測定峰面積，考察方法的穩定性。

1.4.4 重復性試驗 取同一批狗尾草種子粉末，按1.3.3節方法制備游離氨基酸和水解氨基酸的供試品溶液并衍生化，進行HPLC分析，平行測6次，測定峰面積，并計算氨基酸含量，考察方法的重復性。

1.4.5 加標回收率試驗 (1)游離氨基酸加樣回收率。 精密稱取已知氨基酸含量的狗尾草種子粉末(與重復性試驗同批次)0.25 g，加入混合氨基酸標準溶液1 mL，按游離氨基酸檢測方法分別提取、衍生、進樣，平行6 次，計算各氨基酸的回收率。

(2)精密稱取已知氨基酸含量的狗尾草種子粉末0.05 g，加入混合氨基酸標準溶液1 mL，按水解氨基酸檢測方法分別提取、衍生、進樣，平行6 次，計算各氨基酸的回收率。

1.5 氨基酸含量測定

取狗尾草種子樣品，按本研究建立的RP-HPLC法分別測其游離氨基酸和水解氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 HPLC方法考察

2.1.1 線性關系 由表1可見， 21種氨基酸的檢測濃度在0.001 9～2.700 0 μmol/mL內與各自峰面積呈良好的線性關系，相關系數R2均≥0.999 0。

表1 21種氨基酸的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations of 21 amino acids

2.1.2 精密度 21種氨基酸峰面積的相對標準偏差(RSD) 在0.61%～1.12%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩定性 在0～12 h，21種氨基酸峰面積的RSD在0.62%～2.23%(n=9)，表明供試品溶液在12 h內比較穩定。

2.1.4 重復性 21種游離氨基酸相對含量的RSD 在0.91%～2.41%(n=6)，21種水解氨基酸相對含量的RSD 在0.82%～2.31%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.1.5 加樣回收率 21種游離氨基酸的平均回收率在87.50%～100.20%，RSD在0.82%～2.46%。21種水解氨基酸的平均回收率在91.10%～100.21%，RSD 在0.52%～2.08%。

2.2 狗尾草種子中的氨基酸含量

樣品色譜圖見圖1。

圖1 狗尾草種子中氨基酸含量測定的高效液相色譜a.標準品;b.游離氨基酸;c.水解氨基酸;1.天冬氨酸;2.谷氨酸;3.天冬酰胺;4.絲氨酸;5.甘氨酸;6.谷氨酰胺;7.組氨酸;8.蘇氨酸+脯氨酸+丙氨酸;9.精氨酸;10.酪氨酸;11.纈氨酸；12.胱氨酸;13.甲硫氨酸;14.半胱氨酸+亮氨酸+異亮氨酸;15.苯丙氨酸;16.色氨酸;17.賴氨酸

狗尾草種子中游離氨基酸總量可達到5.4%，水解后的氨基酸總量可達到45.7%。由表2可見，狗尾草種子中游離氨基酸含測定的全部21種氨基酸，氨基酸的含量豐富而全面；含量最高的為天冬酰胺(2 260.18 mg/hg)，其次是精氨酸(636.66 mg/hg)，胱氨酸的含量最低(20.71 mg/hg)。

21種水解氨基酸含量明顯比游離氨基酸含量高，在水解氨基酸中，人體必需的氨基酸如色氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸均有，且與其他氨基酸相比，必需氨基酸含量都相對較高，色氨酸含量最低為562.84 mg/hg。水解氨基酸也含有半必需氨基酸精氨酸、組氨酸，其中精氨酸含量較高，達6 731.49 mg/hg，在細胞分裂、傷口復原、免疫功能、激素分泌等方面均有重要作用[11-14]。谷氨酸在生物體內的蛋白質代謝過程中占重要地位，參與動物、植物和微生物中的許多重要化學反應，因其特殊作用，在醫藥、食品及化工等行業有著廣泛的應用,并參與氨的去毒作用[15-16]。狗尾草種子中谷氨酸含量很高，達5 677.48 mg/hg。蛋白質酸水解氨基酸是一種常用的方法，多數氨基酸在酸性條件下較穩定。但在酸水解過程中，色氨酸會被破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺也會脫酰胺基，因此水解后這3種氨基酸含量較低。

表2 狗尾草種子中游離氨基酸和水解氨基酸的種類及含量
Table 2 Types and contents of free amino acids and total amino acids in seeds of Setaria viridis (L.) Beauv. mg/hg

氨基酸種類Aminoacid游離氨基酸Freeaminoacid水解氨基酸Totalaminoacid天冬氨酸Asp69.434057.00谷氨酸Glu94.295677.48天冬酰胺Asn2260.1848.14絲氨酸Ser275.023204.05甘氨酸Gly51.042213.41谷氨酰胺Gln195.74425.50組氨酸His48.641663.41蘇氨酸*+脯氨酸+丙氨酸Thr+Pro+Ala617.564676.18精氨酸Arg636.666731.49酪氨酸Tyr131.461356.00纈氨酸*Val224.002024.98胱氨酸Cys-Cys20.711991.55甲硫氨酸*Met247.792024.18半胱氨酸+亮氨酸*+異亮氨酸*Cys+Leu+Lle112.114268.33苯丙氨酸*Phe158.253237.35色氨酸*Trp125.78562.84賴氨酸*Lys120.341557.93

注：**代表必需氨基酸。

Note：*indicates essential amino acids.

3 討 論

本研究在預試驗中，對不同濃度鹽酸進行了考察，發現當鹽酸濃度較低時,有利于色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺水解及檢測，但整體水解效果不佳；當鹽酸濃度為6 mol/L時，除色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺3種氨基酸外，其余氨基酸水解效果最佳，因此本試驗采用6 mol/L鹽酸水解氨基酸。在以往的研究中，水解氨基酸時未對色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺進行測定[17-19]，本試驗對這3種氨基酸也進行了檢測，但水解后的含量不能準確測定，因此若要檢測此3種水解氨基酸含量應采用其他水解方法。

本試驗建立了一種利用反相高效液相色譜測定狗尾草種子中游離氨基酸和水解氨基酸含量的方法。該方法穩定、快速、精密度高、線性范圍寬，適用于狗尾草種子中游離氨基酸和水解氨基酸含量的測定。本試驗結果表明，狗尾草種子中含有所有人體必需的氨基酸，游離氨基酸總量可達到5.4%，水解后的氨基酸總量可達到45.7%，可見狗尾草種子中氨基酸的資源極其豐富，是一種可以充分利用的資源，有著很好的實際利用價值和廣闊的開發前景。

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Determination of amino acids in seeds ofSetariaviridis(L.) Beauv. by pre-column derivatization RP-HPLC

ZHAO Yan1,TANG Guo-sheng1,HOU Ying-ying1,GAO Yu-gang1,WANG Shi-jie2,CAI En-bo1,ZHANG Lian-xue1

(1ChineseMedicineMaterialCollegeofJilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2CollegeofChineseMedicine,JilinAcademyofAgriculturalScienceandTechnology,Jilin,Jilin132101,China)

【Objective】 This study aimed to establish a method for determinating the contents of free and hydrolyzed amino acids from seeds ofSetariaviridis(L.) Beauv.by pre-column derivatization RP-HPLC.【Method】 The sample solution including free and hydrolyzed amino acids from the seeds ofSetariaviridis(L.) Beauv was prepared before being derived with phenyl isothiocyanate and triethylamine,and detected by HPLC.The precision,stability,and repeatability were detected before gradient elution chromatography was applied to determine the contents of free and hydrolyzed amino acids.【Result】 The 21 amino acids had good linearity in the range of 0.001 9-2.700 0 μmol/mL with correlation coefficients all over 0.999 0.The average recovery of free amino acids was 87.50%-100.20% (RSD=0.82%-2.46%).The average recovery of total amino acids was 91.10%-100.21%(RSD=0.52%-2.08%).There were essential amino acids and semi essential amino acids for human in seeds ofSetariaviridis(L.) Beauv.But tryptophan,asparagine,and histamine amide were compromised after hydrolysis.【Conclusion】 The established method was sensitive,accurate,reproducible,and reliable for determination of amino acids.Both free and hydrolyzed amino acids were rich in seeds ofSetariaviridis(L.) Beauv.

seeds ofSetariaviridis(L.) Beauv.；amino acids；RP-HPLC；pre-column derivation

時間:2015-08-05 08:57

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.026

2014-01-27

國家科技支撐計劃項目(2011BAI03B01)；國家公益性行業科研專項(201303111)；科技部科技人員服務企業項目(2009GJB10031)；吉林省科技發展計劃項目(20130303094,20140204013YY，YYZX201258，20140311050YY)

趙 巖(1979-)，男(滿族)，吉林長春人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學成分與生物活性研究。 E-mail：zhyjlu79@163.com

張連學(1955-)，男，吉林長春人，教授，博士，主要從事藥用植物栽培與加工研究。E-mail：zlx863@163.com

R917

A

1671-9387(2015)09-0185-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0857.052.html