秦巴蛹蟲草原生質體的制備及再生條件研究

馬躍騰，杜雙田，丁 建，紀曉朋，鮑 蕊，李 珍

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

秦巴蛹蟲草原生質體的制備及再生條件研究

馬躍騰，杜雙田，丁 建，紀曉朋，鮑 蕊，李 珍

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究秦巴蛹蟲草原生質體制備及再生的最適條件，建立高效制備和再生原生質體的方法?！痉椒ā?以秦巴蛹蟲草無性型菌株CM-16為材料，研究細胞壁裂解酶種類、酶解時間、酶解溫度、菌絲體菌齡及穩滲劑種類對原生質體制備及再生效果的影響，并在單因素試驗結果基礎上進行正交優化試驗?！窘Y果】 (1)以0.6 mol/L NaCl為穩滲劑，用混合酶(質量分數1%纖維素酶和質量分數0.5%蝸牛酶按1∶1體積比混合)在(26±1) ℃對菌齡6 d的菌絲酶解3 h，原生質體的產量最高。(2)以0.6 mol/L甘露醇為穩滲劑，用混合酶(質量分數1%纖維素酶和質量分數0.5%蝸牛酶按1∶1體積比混合)在(26±1) ℃對菌齡5 d的菌絲酶解2 h，原生質體的再生率最高；驗證試驗結果表明，在此條件下，原生質體再生率平均為25.7%，此時原生質體平均產量為83.42×105mL-1?！窘Y論】 對酶解溫度、酶解時間、菌絲體菌齡、穩滲劑及酶系種類等條件的優化，可提高秦巴蛹蟲草原生質體的產量及再生率。

秦巴蛹蟲草；原生質體；原生質體制備；原生質體再生

原生質體技術是細胞生物工程育種新技術[1]，圍繞原生質體技術衍生出了很多新技術，如原生質體再生無性系[2-5]、單核原生質體技術[6-7]、原生質體誘變技術、原生質體融合以及原生質體技術與分子生物學相結合的方法。目前，除馴化野生菌種外，理化誘變和原生質體技術仍是食用菌菌種選育的重要手段[8]。據報道，通過原生質體技術可保持菌種優良性狀，或進一步提高原始菌株的菌種活力，還可提供新優的變異材料[8-11]。

秦巴蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)是麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲生真菌，生長在陜西秦巴山區，其形態結構和活性成分與冬蟲夏草相近[12-13]，前人對秦巴蛹蟲草的研究主要集中于其藥理成分、人工培養等方面[12-14]，迄今未見有關秦巴蛹蟲草原生質體研究的資料報道。本試驗采用菌絲體酶解法，對秦巴蛹蟲草原生質體制備及再生的最適條件進行研究，以期建立較完善的秦巴蛹蟲草原生質體遺傳轉化系統，為秦巴蛹蟲草的菌種復壯、改良和誘變育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與培養基 菌種：秦巴蛹蟲草無性型(Cordycepsmilitaris)，菌株編號CM-16，由西北農林科技大學生命科學學院提供。

穩滲劑：將NaCl、MgSO4、甘露醇和葡萄糖分別以3.51，7.20，10.92，10.80 g溶解于100 mL磷酸緩沖液中，配制成0.6 mol/L溶液，高壓滅菌30 min，4 ℃保存備用。

酶液：質量分數為1%的纖維素酶、質量分數為0.5%的蝸牛酶及二者的混合酶(體積比1∶1)。將固體酶按比例稱好后溶于穩滲劑中，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存備用。

母種培養基：馬鈴薯200 g/mL，蛋白胨2.0 g/mL，葡萄糖10 g/mL，蔗糖10 g/mL，KH2PO41.0 g/mL，MgSO40.5 g/mL，瓊脂12 g/mL，H2O 1 000 mL，pH 7.0。

液體培養基：蛋白胨10 g/mL，葡萄糖10 g/mL，蔗糖10 g/mL，KH2PO41.0 g/mL，MgSO40.5 g/mL，檸檬酸鐵銨0.5 g/mL，H2O 1 000 mL，pH 7.0，采用250 mL的三角瓶，每瓶裝80 mL，瓶中放少量玻璃珠。

原生質體再生培養基：在母種培養基中加入穩滲劑 NaCl，使其終濃度為0.6 mol/L，pH 7.0。

1.1.2 試 劑 纖維素酶(MP Biomedicals安倍醫療器械公司)及蝸牛酶(Wolsen熱默爾生物科技有限公司)購于陜西楊凌宇晨化玻站，其他化學試劑為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 液體菌種的培養 取活化的秦巴蛹蟲草斜面菌種接于液體培養基中，在180 r/min、23 ℃下培養7 d。

1.2.2 原生質體的制備 原生質體的制備及純化參照張銀萍等[15]的方法。準備50 mL離心管，稱質量并記錄。將培養好的液體菌種倒入無菌離心管中，6 000 r/min離心10 min，吸出上清液，用穩滲劑洗滌沉淀2次再次離心，收集菌絲體并稱質量。根據菌絲體質量，在無菌條件下按1∶1(菌絲體質量(g)∶酶液體積(mL))比例加入酶液，于25～30 ℃下酶解2.5～3 h，間歇振蕩，整個過程需無菌操作。

1.2.3 原生質體的純化 將酶解液6 000 r/min離心10 min，棄去酶液，沉淀為原生質體及細胞碎片的混合物，用穩滲劑清洗沉淀3次以除去酶液；再用穩滲劑重新懸浮沉淀，2 500 r/min離心10 min，取上清液，棄去沉淀，沉淀為大部分細胞碎片。將上清液于6 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀即為原生質體，加入與酶液等體積的穩滲劑懸浮沉淀，即得到純化的原生質體懸液，用血球計數板計數。用穩滲劑將原生質體懸液稀釋至106～108mL-1。

1.2.4 原生質體的再生 吸取0.2 mL原生質體稀釋液涂布于再生培養基上，23 ℃避光培養5～8 d，待菌落數穩定后計數，計算原生質體再生率。對照組用無菌水稀釋后涂布于再生培養基。每個試驗重復5次，結果取5次的平均值。

原生質體再生率=(原生質體再生菌落數-對照組菌落數)/原生質體總數×100%。

1.2.5 單因素對蛹蟲草原生質體制備及再生的影響 (1) 裂解酶種類。以0.6 mol/L NaCl為穩滲劑，在pH 7.0、(26±1) ℃條件下對菌齡為5 d的菌絲體酶解2.5 h，裂解酶分別為質量分數1%的纖維素酶、質量分數0.5%的蝸牛酶及二者體積比1∶1的混合酶，并再生培養原生質體，研究裂解酶種類對原生質體產量及其再生率的影響。

(2)酶解時間。以0.6 mol/L NaCl為穩滲劑，在pH 7.0、(26±1) ℃條件下，利用混合酶酶解菌齡為5 d的菌絲體，酶解時間分別為1，2，3，4和5 h，并再生培養原生質體，研究酶解時間對原生質體產量及其再生率的影響。

(3)酶解溫度。以0.6 mol/L NaCl為穩滲劑，利用混合酶對菌齡為5 d的菌絲體酶解2.5 h，酶解溫度分別為15，20，25，30和35 ℃，pH 7.0，并再生培養原生質體，研究酶解溫度對原生質體產量及其再生率的影響。

(4)菌絲體菌齡。以0.6 mol/L NaCl為穩滲劑，在pH 7.0、(26±1) ℃條件下用混合酶對菌絲體酶解2.5 h，菌絲體菌齡分別為4，5，6，7和8 d，并再生培養原生質體，研究菌齡對原生質體產量及其再生率的影響。

(5)穩滲劑種類。在pH 7.0、(26±1) ℃條件下，用混合酶對菌齡為5 d的菌絲體酶解2.5 h，穩滲劑分別是NaCl、葡萄糖、甘露醇和MgSO4，濃度均為0.6 mol/L，再生培養原生質體，研究穩滲劑種類對原生質體產量及其再生率的影響。

1.2.6 蛹蟲草原生質體制備及再生的正交試驗 依據單因素試驗結果篩選出各因素的適宜范圍進行正交組合試驗，確定秦巴蛹蟲草原生質體制備及再生的最佳條件；對秦巴蛹蟲草原生質體再生的最佳條件進行驗證，觀察并記錄原生質體產量、再生率及再生菌落特征。

2 結果與分析

2.1 單因素對蛹蟲草原生質體制備及再生的影響

2.1.1 裂解酶種類 由圖1可見，用混合酶制備原生質體的效果最好，同時原生質體再生率也最高。與蝸牛酶相比，單獨使用纖維素酶制備原生質體的效果相對最差，同時其原生質體的再生率也較低。此結果說明：(1)原生質體產量較高時，再生率也較高；(2)混合酶比單一酶制備原生質體的效果好；(3)蝸牛酶酶解效果優于纖維素酶。這是因為蝸牛酶是含有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等20多種酶的復合酶，而纖維素酶主要由外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，由于高等真菌的細胞壁成分比較復雜，因此蝸牛酶酶解細胞壁的效果更好。

2.1.2 酶解時間 酶解時間對秦巴蛹蟲草原生質體產量及再生率的影響見圖2。

圖1 裂解酶種類對秦巴蛹蟲草原生質體產量及再生率的影響Fig.1 Effect of lyase type on protoplasts yield and regeneration rate of Cordyceps militaris

圖2 酶解時間對秦巴蛹蟲草原生質體產量及再生率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on protoplasts yield and regeneration rate of Cordyceps militaris

從圖2可以看出：(1)隨著酶解時間的延長，原生質體產量逐漸增加，在3 h左右時，原生質體產量達到最大值；之后，隨著酶解時間的延長，原生質體產量迅速下降。(2)酶解時間對原生質體的再生率也有明顯影響，隨著酶解時間的延長，原生質體再生率迅速增加，2 h左右時，原生質體再生率達到最大值；超過2 h后，原生質體再生率迅速降低。因為隨著酶解時間的延長，細胞壁裂解程度逐漸加深，原生質體產量逐漸增加，超過一定限度后，會影響細胞膜的穩定性，易引起原生質體不穩定或破裂，其再生率有所下降。

2.1.3 酶解溫度 由圖3可見，隨著酶解溫度的升高，原生質體產量迅速增加，在25～28 ℃時較高，隨著酶解溫度的進一步升高，原生質體產量急劇下降。在25 ℃左右時，原生質體再生率也達到最大值。從曲線的變化趨勢可見，酶解溫度對原生質體產量及再生率的影響較大。因為酶活性對溫度較敏感，在適宜溫度下酶活性高，有利于提高原生質體產量，溫度過高或過低時細胞壁分解較慢，不利于原生質體產量的提高。本試驗采用蝸牛酶與纖維素酶的混合酶進行酶解，一般情況下，蝸牛酶的最適溫度在30～37 ℃，而纖維素酶的最適溫度在35 ℃左右。雖然在35 ℃左右，二者的混合酶能保持較高的活性，但對于蛹蟲草細胞而言，溫度過高易導致細胞內部代謝紊亂，從而導致再生困難；而在25 ℃左右時原生質體產量及再生率均較高。

2.1.4 菌絲體菌齡 由圖4可見，菌絲體菌齡為5 d時，原生質體產量最大，隨著菌齡的增大，原生質體產量逐漸降低，原因可能是老化的菌絲細胞壁不易酶解從而導致原生質體產量下降。原生質體的再生率與菌絲體菌齡也有密切關系，菌齡為4 d時，原生質體再生率較低，可能是因為菌絲過于幼嫩，酶解后原生質體不穩定，再生困難；菌齡為5 d時，原生質體再生率基本達到最大值；之后隨著菌齡的增大，原生質體再生率呈下降趨勢，原因是隨著菌齡加大，菌絲細胞壁加厚，次生物質增多，原生質體的產量下降，再生率也隨之降低。

圖3 酶解溫度對秦巴蛹蟲草原生質體產量及再生率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on protoplasts yield and regeneration rate of Cordyceps militaris

圖4 菌絲體菌齡對秦巴蛹蟲草原生質體產量及再生率的影響Fig.4 Effect of spawn age on protoplasts yield and regeneration rate of Cordyceps militaris

2.1.5 穩滲劑種類 穩滲劑種類對蛹蟲草原生質體產量及再生率的影響見圖5。

圖5 穩滲劑種類對蛹蟲草原生質體產量及再生率的影響

由圖5可見，0.6 mol/L NaCl作為穩滲劑制備原生質體時產量最高，其次為甘露醇，葡萄糖和MgSO4均較低；0.6 mol/L甘露醇作為穩滲劑制備原生質體時再生率最高，其次是NaCl，葡萄糖和MgSO4均較低。

2.2 蛹蟲草原生質體制備及再生條件優化的正交試驗結果

根據單因素試驗結果可知，酶解溫度在25 ℃左右時，原生質體產量及再生率均較高，因此進行正交組合試驗時，采用(26±1) ℃進行酶解，并對酶解時間、菌絲體菌齡、穩滲劑種類、裂解酶種類4個因素采用L16(43×3)正交組合設計試驗，具體見表1。

秦巴蛹蟲草原生質體制備及再生條件優化的正交試驗結果見表2。經極差分析發現，對秦巴蛹蟲草原生質體的產量而言，4個因素影響的大小順序為：酶解時間>裂解酶種類>菌絲體菌齡>穩滲劑種類，即酶解時間對原生質體產量的影響最大，其次是裂解酶種類，菌絲體菌齡和穩滲劑種類均較低，各因素的最優水平組合為A3B3C4D3。對秦巴蛹蟲草原生質體再生率而言，各因素作用的大小順序為：酶解時間>菌絲體菌齡>裂解酶種類>穩滲劑種類，各因素的最優水平組合為A2B2C3D3。

表1 蛹蟲草原生質體制備及再生條件優化的正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test of protoplasts yield and regeneration rate of Cordyceps militaris

表2 蛹蟲草原生質體制備及再生條件優化的正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of protoplasts yield and regeneration rate of Cordyceps militaris

注：*表中括號外數據為原生質體產量的系數，括號內數據為原生質體再生率的系數。

Note:The data out of brackets are protoplast yields,and in brackets are protoplast regeneration rates.

經方差(表3和表4)分析發現，酶解時間對秦巴蛹蟲草原生質體產量及再生率均有顯著影響。

表3 秦巴蛹蟲草原生質體制備條件優化正交試驗結果的方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test of protoplast yield of Cordyceps militaris

注：*:F0.01(3,6)=9.78,F0.05(3,6)=4.76;F0.01(2,6)=10.9,F0.05(2,6)=5.14,*表示影響顯著(P<0.05),** 表示影響極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:F0.01(3,6)=9.78,F0.05(3,6)=4.76;F0.01(2,6)=10.9,F0.05(2,6)=5.14,* Indicates significant level (P<0.05),** Indicates very significant level (P<0.01).The same below.

表4 蛹蟲草原生質體再生條件優化正交試驗結果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test of protoplast regeneration rate of Cordyceps militaris

綜合比較原生質體產量和再生率的分析結果可知，原生質體制備最佳組合的選擇要根據試驗目的進行，若是為了得到高產原生質體，可采用A3B3C4D3組合；若是為了獲得更多的原生質體再生株可采用A2B2C3D3組合。此外，酶解時間以及穩滲劑氯化鈉和甘露醇成本的均衡，也應考慮在內。

為獲得較多原生質體再生株，本研究選擇A2B2C3D3組合多次制備秦巴蛹蟲草原生質體并再生。結果表明，在最優(A2B2C3D3)條件下，原生質體再生率平均為25.7%，產量平均為83.42×105mL-1，且大部分再生菌株的菌絲轉色快，菌落長勢旺盛，明顯優于原始菌株。

3 討 論

原生質體的制備和再生是兩個互相聯系的過程。通常原生質體化程度較高時，再生率也較高，但細胞壁的過度酶解會導致原生質體損壞或破裂，因此獲得高產量原生質體的同時又能得到較多的再生菌株是研究的關鍵。由于高等真菌的細胞壁成分較復雜，因此混合酶比單一酶更適合原生質體的制備[16-18]。酶解時間的長短很大程度上影響著原生質體的產量及再生率，酶解時間過短細胞壁不能完全裂解，原生質體得不到充分釋放；酶解時間過長，原生質體不穩定而影響其再生。酶解溫度影響裂解酶的活性，同時也影響原生質體的代謝效率[16,18]，適宜的酶解溫度有助于裂解酶發揮最佳的裂解作用，同時保證原生質體正常的代謝活動，從而提高細胞壁裂解率。菌絲體的菌齡也很關鍵，老化的菌絲體細胞壁較厚、次生物質多，酶解相對不易，導致原生質體產量下降；幼嫩的菌絲易被過度酶解，再生率相對較低。

本研究經大量試驗發現，大部分秦巴蛹蟲草再生菌株的菌絲長勢旺、轉色快，具有顯著的復壯現象，其原因可能與去壁的原生質體吸收了某些外源物質有關[24]，其機理有待進一步研究。表明原生質體無性系技術可作為蛹蟲草菌種復壯的一種方法。本試驗對秦巴蛹蟲草原生質體制備及再生最適條件的研究具有重要意義。利用原生質體技術建立秦巴蛹蟲草遺傳轉化系統，是從分子水平進一步了解秦巴蛹蟲草遺傳背景，利用誘變技術、原生質體融合技術和基因工程進行優良菌株選育的基礎工作。

4 結 論

1)酶解溫度、酶解時間、菌絲體菌齡、穩滲劑種類及不同酶系是影響秦巴蛹蟲草原生質體產量及其再生率的關鍵因素。

2)秦巴蛹蟲草原生質體制備的最優條件為：采用0.6 mol/L NaCl作為穩滲劑，在(26±1) ℃下利用混合酶對菌齡6 d的菌絲酶解3 h；原生質體再生的最佳條件為：采用0.6 mol/L甘露醇作為穩滲劑，在(26±1) ℃下用混合酶對菌齡為5 d的菌絲酶解2 h。

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Study on isolation and regeneration of QinbaCordycepsmilitarisprotoplast

MA Yue-teng,DU Shuang-tian,DING Jian,JI Xiao-peng,BAO Rui,LI Zhen

(CollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The purpose of this paper was to study the optimal conditions for isolation and regeneration of QinbaCordycepsmilitaris(C.militaris) protoplasts,and to establish efficient methods for protoplast-regenerated strains.【Method】 Taking CM-16 strains from anamorph of QinbaC.militarisas test material,type of lyase,mycelia age,osmotic pressure stabilizer,enzymolysis time and temperature were studied on isolation and regeneration of protoplasts,and based on the results,the single factor conditions were optimized through orthogonal test.【Result】 (1) Using 0.6 mol/L NaCl,mixed enzymes(1% (wt) cellulase and 0.5% (wt) snailase was mixed by 1∶1 volume ratio),6 d age of mycelia,(26±1) ℃,and 3 h,the protoplasts yield was the highest.(2) Using 0.6 mol/L mannitol,mixed enzymes(1% (wt) cellulase and 0.5% (wt) snailase was mixed by 1∶1 volume ratio),5 d age of mycelia,(26±1) ℃,and 2 h,the protoplasts regeneration rate was the highest.The verification test results showed that the average rate of regenerated protoplasts was 25.7% and the average yield of protoplasts was 83.42×105mL-1.【Conclusion】 The optimization of enzymolysis temperature and time,mycelia age,osmotic pressure stabilizer and enzyme type was essential to increase the protoplasts yield and regeneration rate of QinbaC.militaris.

QinbaCordycepsmilitaris;protoplasts;protoplast isolation;protoplast regeneration

時間:2015-08-05 08:57

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.028

2014-02-21

陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2011KTCL02-16)

馬躍騰(1988-)，女，寧夏銀川人，在讀碩士，主要從事微生物資源與利用研究。E-mail:24984313@qq.com

杜雙田(1961-)，男，陜西扶風人，副教授，主要從事食用與藥用真菌研究。E-mail:dst6107@126.com

Q935;S567.3

A

1671-9387(2015)09-0196-07

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0857.056.html