典型環亞胺類毒素大氣壓化學電離質譜分析

王艷龍，陳軍輝，李兆永，王 帥，鄭曉玲，王小如,2

(1.國家海洋局第一海洋研究所，海洋生態研究中心，山東 青島 266061；2.廈門華夏職業學院，福建 廈門 361024)

環亞胺類毒素(cyclic imines，CIs)是一類海洋脂溶性藻毒素，其特點是均含有環狀亞胺結構，主要包括以下幾類化合物：Spirolides(SPXs)、Gymnodimines(GYMs)、Pinnatoxins(PnTxs)、Pteriatoxin(PtTxs)、Prorocentrolides和Spiro-prorocentrimine等[1]。環亞胺類毒素可使神經產生急性中毒，最大的毒性特點是對動物快速致死。雖然現在還沒有關于環亞胺類毒素造成人類中毒的報道，但是歐洲食品安全局已經要求用更多的環亞胺類毒素數據來評估其給貝類消費者帶來的健康風險[2]。GYMs和SPXs是最具代表性、也最為常見的環亞胺類毒素，近年來在世界不同地區的貝類、浮游生物以及海洋環境中均有發現[3-9]。由此可見，環亞胺類毒素對人類健康的潛在威脅不容忽視，研發環亞胺類毒素的有效檢測方法非常必要。

自20世紀90年代GYMs和SPXs被發現以來，根據它們快速致死的特征，小鼠生物活體測定方法[10]一直被用于該類毒素的檢測。為了解決小鼠生物活體測定法存在假陽性結果和無法準確定量等問題，液相色譜法[11]、根據分子之間相互作用的受體檢測法[12-13]和液相色譜-電噴霧質譜聯用法[9,14]等開始逐漸用于典型環亞胺類毒素的檢測。質譜作為檢測器，具有靈敏度高、選擇性好，以及可以提供待測物結構信息等優點，在海洋藻毒素檢測領域展現出了廣闊的應用前景。然而，電噴霧質譜法(ESI-MS)在測量基質復雜的樣品時容易受到基質的干擾[15]，造成測量結果偏差較大；而大氣壓化學電離(APCI)是另一種軟電離技術，與ESI-MS技術相比，其抗基質干擾能力較強[16]，常用于ESI-MS檢測效果不佳的弱極性化合物的檢測。目前，采用大氣壓化學電離質譜法(APCI-MS)對環亞胺類毒素進行檢測的研究還未見報道。

本研究擬采用大氣壓化學電離-離子阱質譜(APCI-IT-MS)技術對2種典型環亞胺類毒素(GYM和SPX1)的一級、多級質譜特征進行研究，與ESI-MS法進行抗基質干擾能力比較，并對液相色譜-大氣壓化學電離質譜法(LC-APCI-MS2)檢測GYM和SPX1的方法重復性、穩定性等進行考察，以期為LC-APCI-MS2法測定環亞胺類毒素提供實驗依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

1200型高效液相色譜儀：美國Agilent公司產品，配有四元泵、DAD檢測器、自動進樣器等；6320型離子阱質譜儀：美國Agilent公司產品，配有ESI離子源和APCI離子源；Milli-Q超純水處理系統：美國Millipore公司產品；KQ-400KDE型高功率數控超聲波儀：昆山市超聲儀器有限公司產品；R201型旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司產品；氮吹儀：安譜公司產品；Himac CR22GII高速冷凍離心機：日本HITACHI公司產品。

環亞胺類毒素標準溶液GYM 和SPX1：加拿大國家海洋研究中心產品；甲醇、乙腈(色譜純)：美國Tedia公司產品；氨水(質譜純)：瑞士Fluka公司產品；超純水：由Milli-Q超純水系統制得。

沉積物樣品：于2012年5月28日采自杭州灣海域，保存于-20 ℃冰箱中；海水樣品：采自青島市近岸海域，保存于4 ℃冰箱中；赤潮藻樣品：本實驗室培養的利瑪原甲藻；貝類樣品(紫貽貝)：購自青島水產品市場，購買后立即低溫運回實驗室，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 標準溶液的配制

取0.5 mL標準品各1瓶，用甲醇稀釋并定容至5 mL，得250.1 μg/L GYM和7 053 μg/L SPX1的標準儲備液(單標)；然后用甲醇稀釋成5.003 μg/L GYM和56.42 μg/L SPX1的混合標準溶液。所有標準溶液于-20 ℃保存，備用。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 ZORBAX Extend-C18色譜柱(3 mm×150 mm×3.5 μm)；流動相：A為水，B為甲醇；洗脫梯度：0～5～22～27 min，20%B～64%B～100%B～20%B；流速0.4 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫：室溫(20～23 ℃)。

1.3.2APCI-MS條件 正離子模式，質量掃描范圍m/z100～1 300，霧化氣壓力4.14×105Pa，干燥氣流速5 L/min，干燥氣溫度350 ℃，氣化室溫度400 ℃，毛細管電壓4 kV，裂解電壓143.5 V，錐孔電壓40 V。進行LC-APCI-MS2分析時，離子源各參數不變，采用多反應監測(MRM)模式對目標化合物進行質譜分析。GYM以m/z508 [M+H]+峰為母離子，m/z490的二級子離子[M-H2O+H]+峰為定量離子，碰撞能量為1 V；SPX1以m/z692 [M+H]+峰為母離子，m/z674的二級子離子[M-H2O+H]+峰為定量離子，碰撞能量為1 V。

1.3.3ESI-MS條件 正離子模式，質量掃描范圍m/z100～1 300，霧化氣壓力2.76×105Pa，干燥氣流速11 L/min，干燥氣溫度350 ℃，毛細管電壓4 kV，裂解電壓143.5 V，錐孔電壓40 V。

1.4 基質樣品溶液的制備

空白沉積物樣品提取液、空白海水樣品提取液、空白赤潮藻提取液和空白貝類組織提取液的制備方法參照文獻[17-20]。所有的樣品提取液經0.22 μm尼龍纖維濾膜過濾至液相進樣小瓶中，于-20 ℃條件下避光保存，待用。

取4份200 μL毒素混合標準溶液，將按上述方法制備的4種不同類型的空白樣品基質粗提液稀釋并定容至1 mL，配制成基質標準溶液。GYM、SPX1在不同基質標準溶液中的濃度均為1.001 μg/L和11.28 μg/L。

1.5 方法學考察

1.5.1精密度 取GYM和SPX1混合標準溶液，按1.3節條件重復測定6次，得到GYM和SPX1提取離子峰的峰面積和保留時間。計算GYM和SPX1峰面積和保留時間的相對標準偏差(RSD)，用于評價儀器的精密度。

1.5.2專屬性 在優化的實驗條件下，測定甲醇(溶劑空白)、不同空白基質樣品溶液和不同基質標準溶液，通過對比空白基質樣品溶液與基質標準溶液的檢測結果，評價該方法的專屬性。

1.5.3基質效應 為了評價4種不同類型樣品中基質對目標化合物質譜分析的影響，取按1.4節方法配制的4種不同類型樣品基質標準溶液，通過MS2分析，將測得的各目標化合物峰面積與同一濃度水平甲醇配制的混合標準溶液作對比，來確定4種不同類型樣品中基質對各目標化合物的抑制作用。

1.5.4重復性和穩定性 制備6個每種樣品基質標準溶液的平行樣品，按1.3節條件進行分析，得到各化合物提取離子峰的峰面積，根據峰面積相對標準偏差確定該方法的重復性。測定后的樣品溶液置于4 ℃冰箱中保存，并分別在0、8、24、48、96 h后再進樣測定，得到各化合物的峰面積，以各峰面積的RSD值作為樣品溶液穩定性評價指標。

2 結果與討論

2.1 APCI質譜分析特征

2.1.1APCI-MS分析特征 采用APCI正負切換全掃描模式對GYM和SPX1標準品進行分析，結果發現，這兩種典型環亞胺類毒素只在APCI+模式下有質譜響應，APCI-模式下并沒有質譜信號。GYM和SPX1在APCI+模式下形成的準分子離子[M+H]+峰(基峰)分別為m/z508和m/z692，在一級質譜檢測過程中未發現[M+Na]+和[M+NH4]+峰等，其一級質譜圖示于圖1。GYM和SPX1在APCI+模式下與在ESI+模式下的一級質譜圖基本一致。文獻[21-22]采用ESI離子源進行GYM和SPX1質譜分析，在ESI+模式下，GYM和SPX1也均生成準分子離子[M+H]+峰(基峰)。

2.1.2APCI-MSn分析特征及裂解規律 在一級質譜分析的基礎上，分別以m/z508和m/z692離子峰作為母離子，對GYM和SPX1進行APCI多級質譜分析，結果示于圖2和圖3。

圖1 GYM(a)和SPX1(b)大氣壓化學電離質譜的一級質譜圖Fig.1 MS spectra of GYM (a) and SPX1 (b) by APCI-MS

圖2 GYM大氣壓化學電離質譜的二級(a)和三級(b)質譜圖Fig.2 MS2 (a) and MS3 (b) spectra of GYM by APCI-MS

圖3 SPX1大氣壓化學電離質譜的二級(a)和三級(b)質譜圖Fig.3 MS2 (a) and MS3 (b) spectra of SPX1 by APCI-MS

GYM的APCI-MS2分析結果主要得到m/z490子離子峰(基峰)，推測為準分子離子m/z508失去一分子水([M+H-H2O]+)所形成，由于m/z490子離子峰的豐度高、穩定性好，故在GYM分析中被選為定量離子。除m/z490外，還可以觀察到豐度很低的m/z410子離子峰，推測為母離子m/z508失去碎片-C5H6O2所形成。

選擇m/z490子離子峰進行APCI-MS3分析，可以看出，m/z392子離子峰豐度最高，同時形成m/z472、462、446、378、162等碎片離子峰。推測m/z392離子為m/z490離子峰失去碎片-C5H6O2所形成，m/z378離子為m/z392繼續失去中性碎片-CH2所形成，m/z472離子為m/z490離子峰失去一分子水所形成，m/z462離子為m/z490離子峰失去碎片-CO所形成，m/z446離子為m/z490離子峰失去中性碎片-CO2所形成。m/z162離子應為文獻[23-24]中指出的含有環亞胺結構的碎片離子，其裂解途徑示于圖4a。

圖4 GYM(a)和SPX1(b)的裂解途徑Fig.4 Fragment pathways of GYM (a) and SPX1 (b)

從圖3可以看出，SPX1在APCI-MS2分析中主要得到一系列失水碎片離子，分別為m/z674([M+H-H2O]+)、m/z656([M+H-2H2O]+)和m/z638([M+H-3H2O]+)等。同時還形成了豐度較低的碎片離子m/z426，推測為準分子離子m/z692丟失中性碎片-C15H22O3后再失去一分子水形成的，其裂解途徑示于圖4b。選取二級質譜圖上豐度最大的m/z674離子作為三級質譜分析的母離子，可以看出，裂解得到的仍是一系列失水碎片離子(m/z656、638和620)。

2.2 LC分離條件及APCI-MS靈敏度考察

乙腈-水和甲醇-水是環亞胺類毒素LC分離時常用的流動相，本實驗比較了乙腈-水和甲醇-水作為流動相時，GYM和SPX1的色譜分離效果。結果表明，使用這兩種流動相時，GYM和SPX1的分離效果相似，但為了降低APCI離子源電暈放電針上的積碳效應，選擇了甲醇-水作為流動相。在此基礎上，對LC-APCI-MS和LC-ESI-MS分析GYM和SPX1標準品(濃度分別為1.001 μg/L和11.28 μg/L)的靈敏度進行比較，結果示于圖5。兩種毒素在APCI條件下的EIC色譜峰信噪比(S/N)優于ESI條件下的信噪比。由于信噪比的提高，使得兩種毒素在APCI條件下的檢出限(GYM和SPX1分別為1.00 pg和5.64 pg)比ESI條件下的檢出限(GYM和SPX1分別為5.00 pg和28.2 pg)降低了大約5倍。

2.3 LC-APCI-MS2方法學考察

2.3.1基質效應 在LC/MS2分析復雜基質樣品的過程中，與分析物共流出的基體中內生化合物對MS2檢測靈敏度有重要的影響[22]，在很大程度上，基質效應與提取物類型有關[25]。本研究選取4種不同類型樣品基質，考察了LC-APCI-MS2方法檢測GYM和SPX1的抗基質干擾能力，并與LC-ESI-MS2方法進行比較，結果列于表1?？梢钥闯?，雖然不同樣品基質均能對目標化合物產生不同程度的基質影響，但APCI條件下產生的基質效應比ESI條件下產生的影響小，這更有利于目標化合物的準確測定。本研究的目的是探明典型環亞胺類毒素APCI-MS的分析特征，因此，并沒有針對不同樣品基質的特點優化色譜分離條件。在將APCI-MS2應用于實際樣品分析時，可在本研究的基礎上，進一步優化色譜分離條件，最大程度的降低樣品基質影響，以獲得最佳的檢測靈敏度和準確度。

注：a.GYM,ESI+;b.SPX1,ESI+;c.GYM,APCI+;d.SPX1,APCI+圖5 GYM和SPX1的LC-APCI/ESI-MS提取離子流圖Fig.5 EICs of GYM and SPX1 by LC-APCI/ESI-MS

基質標準溶液化合物(定量離子，m/z)ESI抑制率/%APCI抑制率/%沉積物GYM(4901)-123-560SPX1(6744)-175-145海水GYM(4901)+117-111SPX1(6744)+113+050赤潮藻體GYM(4901)-815-472SPX1(6744)+152+810貝類組織GYM(4901)-302-134SPX1(6744)-171-920

注：+表示信號增強；-表示信號抑制

2.3.2專屬性 采用1.3節條件對試劑空白(甲醇)、不同樣品空白和不同基質標準溶液進行測定，結果表明(以沉積物基質為例)，在試劑空白和不同樣品空白中均未檢測出相應的毒素，而在基質標準溶液中檢測出了GYM和SPX1，結果示于圖6，說明本方法具有良好的專屬性。

2.3.3精密度、重復性和穩定性 精密度實驗結果顯示，GYM和SPX1化合物的峰面積RSD不大于4.25%，保留時間RSD不大于0.24%，說明儀器具有較好的精密度。APCI條件下，4種不同基質中兩種毒素的峰面積RSD均小于10.0%，表明該方法的重復性和穩定性良好，能滿足不同基質樣品中SPX1和GYM藻毒素同步測定的要求，結果列于表2。

圖6 LC-APCI-MS2分析沉積物基質標準溶液的TIC(a)和EICs(GYM(b)和SPX1(c))圖 Fig.6 TIC (a) and EICs (GYM (b) and SPX1 (c)) of spiked marine sediment sample by LC-APCI-MS2

表2 LC-APCI-MS2分析重復性和穩定性的實驗結果(n=6)Table 2 Results of repeatability and stability by LC-APCI-MS2 (n=6)

3 結論

本研究解析了2種典型環亞胺類毒素(GYM和SPX1)在APCI條件下的一級和二級質譜特征以及多級質譜裂解規律。實驗表明，APCI-MS法的靈敏度和抗基質干擾能力均好于ESI-MS法，說明APCI-MS法更適于典型環亞胺類毒素的分析。此外，采用LC-APCI-MS2法分析沉積物、海水、赤潮藻以及生物體基質樣品，均能獲得良好的方法專屬性、重復性和穩定性，這為發展LC-APCI-MS2法定性、定量分析不同基質復雜樣品中環亞胺類毒素打下了良好的實驗基礎。后續工作可在本研究的基礎上，針對不同樣品的特點，采取合適的樣品前處理方法，以開發APCI-MS分析不同類型樣品中典型環亞胺類生物毒素的有效方法。

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