三黃片對糖尿病模型大鼠氧化應激水平的影響實驗

王芳玲 田風勝 王元松 馬小允 賈彩霞 王慶凱宋哲

（滄州醫學高等?？茖W校中醫教研室，河北滄州 061001）

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，機體內高活性分子，如反應性氧化物和活性氮簇，產生過多或消除減少，從而導致組織損傷［1］。糖尿病合并動脈硬化是糖尿病慢性并發癥的共同病理基礎，氧化應激參與了動脈硬化的過程［2-3］。三黃片為臨床常用清熱類中藥復方制劑，具有清熱解毒的功效，研究表明清熱類中藥具有良好的抗氧化作用［4］。我們以丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）為觀察指標，探討三黃片對糖尿病模型大鼠氧化應激水平的影響，結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性Wistar大鼠50只，清潔級，體質量180～220 g，均由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號1009065。

1.2 主要試劑及儀器三黃片（哈藥集團三精黑河藥業有限公司，國藥準字Z20053409）;SOD試劑盒、MDA試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所;鏈脲佐菌素（STZ）、檸檬酸鈉（美國Sigma公司）;戊巴比妥鈉（石家莊華瑞創新生物科技開發中心）;冰醋酸（河北健寧醫藥化工廠）;無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）;7600-010型全自動生化分析儀（日本日立公司）;752N型紫外-可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）;美國雅培安妥超越血糖儀，XCF028-1009型。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備［5-6］將50只大鼠隨機分為2組，正常組12只，造模組38只。造模組大鼠禁食12 h后，將STZ用檸檬酸鈉緩沖液配制成濃度1%、pH 4.2的溶液，按60 mg/kg一次性腹腔注射;正常組予等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。72 h后尾靜脈取血，測血糖≥16.7 mmol/L;尿糖（+ ++）～（++++），即可確定為糖尿病大鼠造模成功，穩定1周后列入研究對象。

1.3.2 分組及給藥方法造模成功后，隨機選取造模成功大鼠24只，分為糖尿病組、三黃片組，各12只。三黃片組給予三黃片研末10 g/kg灌胃;正常組、糖尿病組予等容積純凈水灌胃。給藥期間觀察大鼠飲水、活動、體質量及毛色等一般情況的變化。

1.4 觀察指標及方法3組大鼠均連續灌胃飼養8周后，禁食12 h，取尾靜脈血測定血糖，然后以3%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）腹腔注射麻醉，迅速開腹，分離腹主動脈，從腹主動脈采血，分離血清測定SOD及MDA。同時留取雙側腎臟，在冰冷的0.9%氧化鈉注射液中漂洗，除去血液，濾紙拭干，除去腎包膜，分離皮質，取少許腎皮質加9倍質量預冷的0.9%氯化鈉注射液在冰浴中制成10%腎組織勻漿，低溫離心機離心，吸取上清液，分別檢測SOD及MDA。

1.5 統計學方法采用SPSS 11.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析比較組間差異，有顯著差異者用Student-Newman–Keuls test進行組間多重比較。

2 結果

2.13 組大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖變化比較見表1。

表13 組大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖變化比較mmol/L，±s

表13 組大鼠灌胃前及灌胃8周后血糖變化比較mmol/L，±s

與正常組比較，*P＜0.05

組別n灌胃前灌胃8周后正常組124.88±0.704.88±0.54糖尿病組1223.13±3.43*24.51±3.10*三黃片組1222.38±2.21*23.40±3.21*

由表1可見，3組灌胃8周后血糖水平與本組灌胃前比較差異均無統計學意義（P＞0.05）;糖尿病組及三黃片組灌胃前及灌胃8周后血糖水平均高于正常組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），且糖尿病組與三黃片組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.23 組大鼠灌胃前及灌胃8周后體質量變化比較見表2。

由表2可見，3組灌胃前體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05），體質量相當;灌胃8周后，正常組體質量與本組灌胃前比較增加，差異有統計學意義（P＜0.05）;糖尿病組及三黃片組體質量較灌胃前雖有所下降，但比較差異均無統計學意義（P＞0.05），且2組體質量均低于正常組且（P＜0.05）。

表23 組大鼠灌胃前及灌胃8周后體質量變化比較g，±s

表23 組大鼠灌胃前及灌胃8周后體質量變化比較g，±s

與灌胃前比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05

組別n灌胃前灌胃8周后正常組12196.5±13.6228.4±8.1*糖尿病組12205.7±16.2196.0±16.3△三黃片組12195.5±15.0192.0±12.6△

2.33 組大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比較見表3。

表33 組大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比較±s

表33 組大鼠灌胃8周后血清SOD及MDA水平比較±s

與正常組比較，*P＜0.05;與糖尿病組比較，△P＜0.05

組別nSOD（U/mL）MDA（nmol/mL）正常組12172.19±16.885.72±0.63糖尿病組12104.21±6.96*7.41±0.58*三黃片組12129.68±8.29＊△6.65±0.77＊△

由表3可見，糖尿病組及三黃片組灌胃8周后血清SOD及MDA水平與正常組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），SOD明顯降低，MDA明顯升高，但三黃片組SOD降低幅度及MDA升高幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。

2.43 組大鼠灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平比較見表4。

表43 組大鼠灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平比較±s

表43 組大鼠灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平比較±s

與正常組比較，*P＜0.05;與糖尿病組比較，△P＜0.05

組別nSOD（mg prot）MDA（mg prot）正常組1239.09±4.172.79±0.74糖尿病組1226.73±3.17△4.63±0.92△三黃片組1233.74±3.05△＊3.77±0.55△＊

由表4可見，糖尿病組及三黃片組灌胃8周后腎臟組織SOD及MDA水平與正常組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），SOD均明顯降低，MDA均明顯升高，但三黃片組SOD降低幅度及MDA升高幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。

3 討論

氧化應激作用機制可概括為活性氧分子生成增多或者活性氧分子清除減少，當氧化和抗氧化能力之間有不平衡時，氧化應激發生，糖尿病患者對氧化應激更敏感［7-8］，機體處于明顯的氧化應激狀態［9］。氧化應激是糖尿病慢性并發癥發生發展的中間環節［10］，2004年Ceriello教授首先提出共同土壤學說［11］，即氧化應激是胰島素抵抗、糖尿病及心血管疾病的共同發病基礎。氧化應激在糖尿病發生發展過程中起重要作用，參與了動脈硬化的形成和進展［12］，胰島素抵抗和糖尿病又增加了心血管疾病的發病率和病死率。因此，機體氧化應激水平增強與糖尿病慢性并發癥的發病機制密切相關［13］。

MDA是脂質過氧化的產物，其高低可間接反映機體細胞受氧自由基損傷的程度，研究顯示動脈粥樣硬化患者血清MDA含量顯著升高［14］。SOD是一種糖蛋白，可清除氧自由基及其分解產物，對細胞生物膜具有保護作用［15］。這2項指標常常被應用于反映機體氧化應激水平的研究。腎臟病變是糖尿病常見且重要的慢性并發癥之一，因此我們同時選取大鼠腎臟組織測定SOD及MDA水平，以初步了解三黃片在影響血清SOD及MDA水平的同時對腎臟的作用，為后續研究奠定基礎。

三黃片主要成分為大黃、黃連、黃芩，3味中藥均為苦寒藥，具有清熱解毒、瀉火通便的作用，臨床上多用于治療結膜炎、小兒急性口瘡、急性扁桃體炎、急慢性胃腸炎、黃疸等證屬實熱者［16］。研究表明，清熱類中藥具有明顯抗氧化作用，能升高SOD活性，抑制脂質過氧化［17-19］;同時具有顯著抗動脈硬化的作用，預防糖尿病血管病變［20-22］;還能明顯抑制腎臟細胞間黏附分子-1 （ICAM-1）及血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）水平的表達，對糖尿病腎病有積極防治作用［23］。既往文獻尚無三黃片抗糖尿病氧化應激的研究報道，故本實驗引申清熱類中藥的抗氧化作用，選三黃片作為研究對象。

本研究結果顯示:①灌胃前糖尿病組及三黃片組大鼠血糖水平與正常組比較均顯著升高（P＜0.05），糖尿病組及三黃片組比較無顯著差異（P＞0.05）。灌胃8周后，3組血糖水平較灌胃前比較均無明顯變化（P＞0.05），糖尿病組及三黃片組與正常組比較仍顯著升高（P＜0.05），糖尿病組與三黃片組比較無明顯差異（P＞0.05）。提示三黃片對糖尿病大鼠血糖水平無明顯作用。②灌胃前3組大鼠體質量無差異（P＞0.05）。灌胃8周后，正常組大鼠體質量較灌胃前明顯增加（P＜0.05），糖尿病組及三黃片組較灌胃前均無明顯變化（P＞0.05）。提示糖尿病可影響大鼠正常生長，三黃片對改善大鼠體質量無明顯作用。③灌胃8周后，糖尿病組及三黃片組與正常組比較血清SOD明顯降低（P＜0.05），MDA明顯升高（P＜0.05），且三黃片組變化幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。提示三黃片能夠升高糖尿病大鼠血清SOD水平，降低MDA水平，從血清學水平具有抗氧化應激作用。④灌胃8周后，糖尿病組及三黃片組與正常組比較腎臟組織SOD明顯降低（P＜0.05），MDA明顯升高（P＜0.05），且三黃片組變化幅度均低于糖尿病組（P＜0.05）。提示三黃片能夠升高糖尿病大鼠腎臟SOD水平，降低MDA水平，在組織學水平具有抗糖尿病氧化應激的作用。

本研究結果表明，三黃片對糖尿病模型大鼠具有明顯抗氧化應激作用，可以升高SOD水平，降低MDA水平，預防糖尿病血管病變，預防動脈硬化，保護腎臟組織，從而為拓展清熱類中藥的臨床應用提供了新思路，為新藥的開發提供了實驗依據。

［1］Nicholson KG，Kent J，Ireland DC.Respiratory viruses and exacerbations of asthma in adults［J］.BMJ，1993，307（6910）:982-986.

［2］Ali RJ，Movahed A.Current concepts of cardiovascular diseases in diabetes mellitus［J］.Int J Cardiol，2003，89（2-3）:123-134.

［3］Johnston SL，Pattemore PK，Sanderson G，et al.Community study of role of viral infections in exacerbations of asthma in 9-11 year old children［J］.BMJ，1995，310（6989）:1225-1229.

［4］韓明，藺志鐸，薛福玲，等.三種中草藥抗氧化性研究［J］.光譜實驗室，2009，26（6）:1480-1484.

［5］張均田.現代藥理實驗方法學［M］.北京:北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社，1998:981.

［6］于德民，吳銳，尹濰，等.實驗性鏈脲佐菌素糖尿病動物模型的研究［J］.中國糖尿病雜志，1995，3（2）: 105-109.

［7］何紅紅，高大中，趙江龍，等.高血壓合并2型糖尿病患者動脈彈性與氧化應激和血管內皮功能的相關性［J］.中國動脈硬化雜志，2009，17（12）:1005-1008.

［8］Penckofer S，Schwertz D，Florczak K.Oxidative stress and cardiovascular disease in type 2 diabetes:the role of antioxidants and pro-oxidants［J］.J Cardiovasc Nurs，2002，16（2）:68-85.

［9］Ziegler D，Sohr CG，Nourooz-Zadeh J.Oxidative stress and antioxidant defense in relation to the severity of diabetic polyneuropathy and cardiovascular autonomic neuropathy［J］.Diabetes Care，2004，27（9）:2178 -2183.

［10］Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54 （6）:1615-1625.

［11］Dandona P，Aljada A，Bandyopadhyay A.Inflamma

tion:the link between insulin resistance，obesity and diabetes［J］.Trends Immunol，2004，25（1）:4-7.［12］Bloch-Damti A，Bashan N.Proposed mechanisms for the induction of insulin resistance by oxidative stress［J］.Antioxid Redox Signal，2005，7（11-12）:1553 -1567.

［13］高瑞霄，姚朱華，邵紅霞.尿8-OHdG與糖尿病性動脈粥樣硬化相關性的研究進展［J］.天津醫藥，2009，37（9）:809-811.

［14］Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications［J］.Nature，2001，414 （6865）:813-820.

［15］Nishikawa T，Edelstein D，Du XL，et al.Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage［J］.Nature，2000，404（6779）:787-790.

［16］王芳玲，田風勝.三黃片臨床應用的研究進展［J］.中醫臨床研究，2011，3（5）:114-115.

［17］楊桂珍，吳莉，梁軍，等.復方丹參片對實驗性糖尿病大鼠LPO含量及SOD水平的影響［J］.陜西中醫，2007，28（3）:372-374.

［18］蔡惠顏，李任先，馮信香.系列“消渴方”的抗氧化作用測定［J］.江西中醫藥，2003，34（245）:39.

［19］茅彩萍，顧振綸.葛根素對糖尿病血管并發癥大鼠血漿ET-NO、ET-ANF動態平衡的影響［J］.中成藥，2004，26（6）:487-489.

［20］田風勝，李振彬，王元松，等.大黃對糖尿病大鼠血管病變保護機制的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2008，14（2）:63-66.

［21］田風勝，王元松，蘇秀海，等.穿心蓮對糖尿病大鼠血管病變保護機制的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2009，15（10）:85-88.

［22］田風勝，李振彬.清熱類中藥在動脈粥樣硬化發展中的保護機制的研究進展［J］.臨床薈萃，2006，21 （13）:977-978.

［23］曹光，王鎂.糖腎安煎劑對糖尿病大鼠氧化應激影響的研究［J］.中華中醫藥學刊，2009，27（4）:761 -762.

（本文編輯:石康）