副豬嗜血桿菌血清5型與4型菌株的差異表達蛋白分析

李 軍，謝宇舟，彭 昊，禤雄標，潘 艷，楊 威，胡 帥，馬春霞，許力干，陳澤祥*

(1.廣西獸醫研究所，廣西南寧 530001；2.廣西獸醫研究所廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西南寧 530001；3.廣西獸藥監察所，廣西南寧 530001)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，可以引起斷奶仔豬纖維素性漿膜炎、腦膜炎和多發性關節炎，是當前導致斷奶仔豬死亡的主要病原[1]。根據Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)方法，將HPS 分為1～15 個血清型，此外，還有約20 %的菌株未能定型。HPS 菌株血清型的差異導致其毒力各不相同，強毒力的血清1、5、10、12、13 和14 型可以在4 d 內導致豬死亡；而中毒力的血清2、4 和15 型主要引起纖維素性漿膜炎和多發性關節炎[2]。

由于HPS 血清型的多樣性，目前對其致病的分子機制還缺乏了解，雖然HPS 血清4、5 和12 型的全基因組序列已經被解析[3-5]，但還需要結合蛋白質組學方法才能夠進一步對HPS 進行系統研究。同位素標記相對和絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術可以對細胞器、細胞裂解液等復雜樣本進行相對和絕對定量研究，具有高通量分離和鑒定蛋白質能力及較好的定量效果和較高的重復性，該技術已經在細菌學研究中用于鑒定差異表達蛋白[6]。

本研究利用iTRAQ 技術結合質譜分析，分析HPS 血清5 型與血清4 型菌株的蛋白質組差異，獲得表達差異的蛋白，并根據蛋白質直系同源簇(Cluster of orthologous Groups of proteins，COGs)數據庫將表達差異的蛋白按照功能進行分類，篩選出HPS 血清5 型和4 型表達差異蛋白，以期為HPS 的研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 菌 株 HPS 血清5 型菌株gx041 和血清4 型菌株gx033 由本實驗室2011 年分離自廣西博白縣瀕死保育豬的肺細支氣管[3,7]。

1.2 主要試劑和儀器 HPS 血清型1～15 的高免兔血清購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；蛋白提取試劑RIPA 裂解液、丙酮、過硫酸銨、TEAB、SDS 等購自Bio-Rad 公司；iTRAQ?Reagent 8 Plex Chemistry 試劑盒、TEAB 等試劑購自ABI 公司。Triple TOF 5600 質譜儀購自AB Sciex 公司。

1.3 菌體蛋白提取時間的確定 將HPS gx041 和gx033 菌株分別接種于含0.05 % NAD 和5 %胎牛血清的TSA 培養基，37 ℃培養復蘇后，復壯3 代，挑單一菌落接種TSB 培養基，37 ℃培養12 h 后，按培養基總體積的10 %接種于TSB 培養基，37 ℃搖床培養；每隔1 h 利用分光光度計測定培養基的OD600nm值，同時取樣進行平板菌落計數。每個菌株重復3 次測定，繪制菌株的生長曲線，確定提取菌體蛋白的時間。

1.4 菌體蛋白的提取 HPS gx041 和gx033 菌株經37 ℃搖床培養31 h 后，4 ℃13 000 r/min 離心10 min收集菌體，PBS 洗滌3 次，收集沉淀。采用RIPA裂解液重新懸浮沉淀菌體，冰浴超聲(9.9 s/間隔9.9 s，200 w)，4 ℃過夜裂解。4 ℃13 000 r/min 離心10 min 后取上清，6 倍體積含0.07 % DTT、10 %TCA 的丙酮溶液沉淀30 min；4 ℃13 000 r/min 離心20 min，棄上清；沉淀物經含0.07 % DTT 的丙酮溶液重新懸浮，4 ℃13 000 r/min 離心10 min，棄上清，重復2 次；裂解液復溶，4 ℃13 000 r/min離心10 min，上清即為待用的菌體蛋白。

1.5 蛋白質酶解和iTRAQ標記 每組蛋白樣品取100 μg，按蛋白∶酶(20∶1)的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h；重復1 次，37 ℃再酶解8 h。真空凍干肽段，加入含0.1 % SDS 的50 % TEAB 復溶。按iTRAQ?Reagent 8 Plex Chemistry 試劑盒的操作方法進行肽段的標記，iTRAQ 8 Plex 114 標記HPS 血清5 型gx041 菌株組，iTRAQ 8 Plex 115 標記HPS血清4 型gx033 菌株組。

1.6 標記肽段的SCX分離和質譜分析 加入8 倍體積的SCX A 液，調節pH 至3。清水清洗柱子，平衡，除鹽，利用0.1 % FA 復溶，進行質譜檢測。

1.7 蛋白質鑒定和定量 應用Mascot 軟件進行蛋白質鑒定。依據蛋白質豐度水平，當差異達到2 倍以上，并且經統計檢驗其p<0.05 時，視為差異表達蛋白質。

1.8 生物信息學分析 根據COGs 數據庫將差異表達的蛋白按照功能進行分類，篩選出HPS 血清5 型的差異表達蛋白，差異表達蛋白的注釋參照HPS 血清12 型ZJ0906 株(CP005384.1)進行。

2 結果

2.1 HPS菌株生長曲線的繪制 HPS gx041 和gx033在TSB 培養基中接種5 h 后，培養基的OD600nm值開始上升，在培養31 h 時，OD600nm值達到峰值，以后隨著時間延長，OD600nm值基本保持水平趨勢(圖1)。根據OD600nm值繪制的HPS 生長曲線與平板菌落計數的結果基本一致，因此，本實驗以HPS 菌株培養31 h 作為提取菌體蛋白的時間。

圖1 HPS 菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of HPS

2.2 iTRAQ標記的蛋白圖譜整體分析 HPS 血清5型gx041 與血清4 型gx033 菌株的蛋白樣品通過iTRAQ 標記后，經Triple TOF 5600 質譜儀分析顯示，共獲得45 540 張肽段譜圖，含6 830 個肽段，其中6 783 個為特有肽段，分屬于874 個蛋白，占HPS 基因組表達蛋白的39.9 %(874/2 189)。在這874 個蛋白中，有超過47.9 %(419/874)的蛋白肽段序列覆蓋度大于50 %(圖2A)。它們的分子量主要集中在10 ku～50 ku(圖2B)。

圖2 iTRAQ 鑒定到的蛋白總概圖Fig.2 Over view of the iTRAQ quantitative proteomics analysis

2.3 表達差異蛋白分析 通過設定蛋白豐度水平的差異達到2 倍以上(p<0.05)，視為差異表達，經統計HPS 血清5 型菌株gx041 有99 個蛋白的表達發生變化，占檢測蛋白總數的11.33 %(99/874)，表達上調的蛋白有86 個，表達下調的蛋白有13 個。根據COGs 數據庫把表達差異的蛋白按照功能進行分類，可以分為能量產生和轉化、離子轉運、氨基酸轉運和代謝、輔酶轉運和代謝、糖轉運和代謝、DNA 復制和損傷修復、RNA 加工和修飾、細胞外結構、細胞膜/壁形成、細胞運動性、轉錄后加工/分子伴侶、轉錄、翻譯/核糖體結構、功能未知14 類(表1)，其中轉鐵結合蛋白1(Tbp1)、熱休克蛋白(GrpE)等24 個蛋白的表達變化在3 倍以上(表2)，占表達差異蛋白總數的24.24 %(24/99)。

表1 HPS 血清5 型菌株表達差異蛋白功能分類Table 1 Biological function classification of differentially expressed proteins of HPS serovar 5

3 討論

研究表明，豬鼻內接種強毒力HPS 菌株12 h后，即可在鼻竇和氣管分離出菌株，強毒菌株在鼻竇和氣管的定植，可以導致氣管纖毛活動的顯著降低和纖毛上皮細胞的損傷，并引發肺部的感染[8-9]。本實驗結果顯示HPS 血清5 型菌株的大黏附素蛋白(Large adhesin)表達為血清4 型菌株的2.1 倍，表明該蛋白可能與菌株侵入機體，定植黏膜表面的能力密切相關，是一個值得研究的蛋白。

表2 HPS 血清5 型菌株表達差異在3 倍以上的蛋白Table 2 Proteins with expressed more than 3-fold of HPS serovar 5

在HPS 血清5 型菌株檢測到的高豐度表達的蛋白中，50S 核糖體蛋白亞基L2、L17、L19、L22、L28、L33 以及30S 核糖體蛋白亞基S3、S6、S7、S9、S10、S11、S12、S16、S18 的表達上調2.45～3.28 倍，核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分，在細胞內蛋白的生物合成中發揮重要作用，它們表達的上調可能會造成細菌生長相對加快，有助于菌株的迅速定植，從而避免被宿主免疫系統清除而能夠在宿主體內生存。

細菌生長繁殖離不開鐵離子，但由于其自身無法生產鐵離子，只能通過強奪宿主的轉鐵蛋白及乳鐵蛋白中的鐵為其提供必需的鐵離子。Charlnad 等的研究表明，HPS 可以通過Tbp1 提供細菌生長必需的鐵離子，Tbp1 可能在HPS 致病過程中起關鍵性作用[10]。本研究表明HPS 血清5 型菌株的Tbp1的表達豐度超過血清4 型菌株3.39 倍，該蛋白有作為潛在的藥物治療靶點的可能。

熱休克蛋白是一類應激反應性蛋白，包括HSP70、HSP40 和GrpE 等家族蛋白，廣泛存在于原核細胞和真核細胞中。熱休克蛋白家族蛋白間的協同作用，促使某些能夠自發折疊的蛋白質正確折疊，形成天然空間構象，本研究中，HPS 血清5 型菌株的GrpE 蛋白表達量為血清4 型菌株的3.33 倍，其潛在的生物學機制還有待進一步研究。同時，尚有7 個蛋白的功能不清楚，有待進一步挖掘，特別是表達豐度差異較大的蛋白更是值得深入研究。

HPS 菌株的外膜蛋白差異極大，而脂多糖成份則很相似，表明HPS 細胞膜的結構與其血清型的區分具有密切關系[11-12]。本研究表明，HPS 血清5 型菌株表達上調的蛋白中，有6 個蛋白與細胞膜的形成有關，特別是外膜蛋白P5，它是細菌定植在宿主上呼吸道表面的必需因子[13-14]，我們此次檢測到的外膜蛋白P5，在HPS 血清5 型菌株中的表達豐度為血清4 型菌株的2.17 倍。因此，外膜蛋白P5 有可能為HPS 菌株間血清型差異的一個影響因子。

本研究應用iTRAQ 技術結合質譜分析，對HPS血清5 型和血清4 型菌株的差異表達蛋白進行了初步分析，獲得的差異表達蛋白將為后續HPS 的研究提供線索。

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