Taq Man熒光定量PCR在飼料沙門氏菌檢測中的應用評估

佘 容，羅 丹，劉耀敏，范秀麗，顏其貴

(1.通威股份有限公司檢測中心，四川成都 610041；2.四川農業大學動物醫學院，四川溫江 611130；3.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川溫江 611130)

沙門氏菌(Salmonella)是一類革蘭氏陰性、有鞭毛的兼性需氧菌，血清型種類繁多，目前全世界已分離鑒定出2 523 種血清型，中國已發現216 種血清型[1]。按其感染癥狀可分為傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌和非傷寒沙門氏菌，其中非傷寒沙門氏菌是腹瀉病和食物中毒最常見的病原之一，在中國報告的細菌性食物中毒中，多年位列病因第一位；而動物食用含有沙門氏菌的飼料，可引起疾病或帶菌，導致動物患胃腸炎、腸熱癥、敗血癥等，從而降低動物生產性能，影響養殖行業發展[2]。沙門氏菌很容易在自然環境及動物體內存活和增殖，飼料原料(包括動物性及植物性原料)、飼料的粉碎加工及打包過程都會引入沙門氏菌而污染飼料[3]。因此，及時、準確地檢測飼料及飼料原料中的沙門氏菌，對預防畜禽疾病發生，提高畜禽產品質量，保護人類身體健康都具有十分重要的意義。傳統的沙門氏菌檢測方法基于選擇性分離培養和生化鑒定，一般需要4 d～6 d，耗時長、檢測效率低下[4]。近年來，國內外相繼開展沙門氏菌的PCR 檢測方法研究[5-6]，大大縮短了檢測時間(2 d～3 d)，且對檢測人員的經驗要求相對較低，但此類研究主要集中在畜禽、食品類樣本，針對飼料類樣本的應用研究還較少。

本研究特針對沙門氏菌特異基因建立飼料中沙門氏菌的Taq Man 熒光定量PCR 檢測方法，進行相關方法學驗證實驗，并與標準方法作比較，以全面評估Taq Man 熒光定量PCR 法應用于飼料沙門氏菌檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 菌株及飼料樣品 沙門氏菌參考菌株(CMCC10115)購自廣州微生物研究所；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溫和氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌、嗜水氣單胞菌、睪丸酮叢毛單胞菌、短芽孢桿菌等菌株均為本實驗室分離鑒定；動物性飼料原料樣品72 份和沙門氏菌陰性魚粉樣品一份均由通威股份有限公司提供。

1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、DHL 瓊脂、酚紅煌綠瓊脂、營養瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)均購自北京陸橋生物技術有限公司；沙門氏菌顯色培養基購自法國科瑪嘉公司；微生物鑒定藥敏卡、微生物鑒定肉湯、微生物藥敏肉湯購自美國BD 公司；細菌DNA 提取試劑盒購自美國OMEGA 公司；PCR Taq Man 熒光反應試劑盒購自美國Bio-Rad 公司；引物和探針由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

表1 PCR 所用引物和探針序列Table 1 Sequence of primers and probes

1.3 菌株培養液的制備及沙門氏菌參考菌株培養液濃度測定 將沙門氏菌標準菌種及其他菌種分別接種于5 mL 胰蛋白胨大豆肉湯，120 r/min，36 ℃振蕩培養過夜備用。調整沙門氏菌菌液麥氏比濁度(MCF)為0.5，取1 mL 按10 倍遞增稀釋(10-1～10-8)，并選擇10-5、10-6、10-73 個稀釋濃度進行傾注平板計數，推算培養液中的細菌數。

1.4 熒光定量PCR法標準曲線建立 以OMEGA細菌DNA 提取試劑盒提取已知濃度沙門氏菌標準菌株培養液DNA，經10 倍梯度稀釋后作為標準品，參照文獻[9]方法，以沙門氏菌JEO402-1 為靶基因進行熒光定量PCR 擴增，擴增產物為261 bp。反應采用20 μL 體系，經優化，PCR 反應體系為：2×SoadvancedTMUniversal Probes Supermix 10 μL，引物Sal-1(10 μg/mL)0.5 μL,引物Sal-2(10 μg/mL)0.5 μL，Sal-probe(10 μg/mL)0.3 μL，DNA 模板0.5 μL，去離子水8.2 μL，PCR 反應程序為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、59.4 ℃30 s、72 ℃30 s，共40 個循環。系統自動收集熒光信號，根據測定的Ct 值和log 細菌濃度繪制標準曲線。

1.5 靈敏度試驗 已知濃度沙門氏菌參考菌株DNA 經10 倍梯度稀釋后作為標準品，進行熒光定量PCR 擴增，同時以無菌蒸餾水為空白對照，系統自動收集熒光信號，根據測定的Ct 值和log 細菌濃度繪制菌液標準曲線，確定檢測方法靈敏度。

1.6 特異性試驗 以OMEGA 細菌DNA 提取試劑盒提取沙門氏菌參考菌株和其他非沙門氏菌菌株基因組DNA 為模板，并以無菌蒸餾水為空白對照，進行熒光定量PCR 擴增，以驗證方法特異性。

1.7 重復性試驗 分別在同一批次和不同批次菌株培養液DNA 梯度稀釋樣本中選取3 個梯度(10-3cfu/mL、10-5cfu/mL、10-7cfu/mL)以熒光定量PCR法重復檢測3 次，每次3 個重復，計算Ct 值的組間和組內變異系數以評估其重復性和穩定性。

1.8 飼料中沙門氏菌檢測

1.8.1 熒光定量PCR 法 無菌操作稱取飼料樣本25 g，加入225 mL BPW，均質后靜置片刻，取上清液1 mL 提取微生物基因組DNA；剩余樣本按傳統培養法經預增菌18 h 和增菌24 h 后分別取上清液1 mL，提取微生物基因組DNA，所得DNA 經全波長酶標儀測定其純度，并以1 %瓊脂糖凝膠電泳驗證合格后作為模板進行熒光定量PCR 擴增。同時以無菌蒸餾水作為空白對照，沙門氏菌參考菌株DNA作為陽性對照，每次試驗均包括空白、陽性對照。檢測結果根據標準《SNT 1059.7-2010 進出口食品中沙門氏菌檢測方法 實時熒光PCR 法》判定樣本沙門氏菌檢出或未檢出。

1.8.2 傳統培養法 無菌操作稱取飼料樣本25 g，加入225 mL BPW，36 ℃預增菌培養18 h 后取10 mL轉入100 mL SC 增菌液，36 ℃增菌培養18 h 后劃線接種至酚紅煌綠瓊脂平板、DHL 瓊脂平板和科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基平板，于36 ℃分離培養18 h～24 h，觀察平板上菌落形態，挑取可疑菌落于營養瓊脂平板上純培養后進行菌株生化鑒定，于BD 全自動微生物鑒定藥敏系統上完成。

1.8.3 兩種檢測方法在飼料沙門氏菌檢測中的最低

檢測限 將已準確定量的沙門氏菌菌液按10 倍遞增稀釋至10-7。無菌稱取沙門氏菌陰性魚粉樣本(經傳統培養法驗證為陰性)9 份，25 g/份，加入225 mL緩沖蛋白胨水，其中8 份分別加入梯度稀釋的沙門氏菌菌液，另1 份不添加以作空白對照，分別按照傳統培養法和熒光定量PCR 法進行沙門氏菌檢測。

1.8.4 飼料樣本檢測 72 份飼料原料樣本，分別按照傳統培養法和熒光定量PCR 法進行沙門氏菌定性檢測，重復檢測3 次，驗證兩種檢測方法在實際樣本中的靈敏度與符合率。

2 結果

2.1 沙門氏菌參考菌株培養液濃度計數 經平板計數檢測推算可得，參考菌株培養液濃度為5×108cfu/mL。取1 mL 參考菌株培養液，加入至250 mL 魚粉的BPW 懸浮樣本中，則加標樣本參考菌株添加濃度依次為2×106cfu/mL、2×105cfu/mL、2×104cfu/mL、2×103cfu/mL、2×102cfu/mL、2×101cfu/mL、2×100cfu/mL、2×10-1cfu/mL。

2.2 熒光定量PCR法驗證

2.2.1 標準曲線及靈敏度性試驗 以梯度稀釋菌液DNA 為標準品進行熒光定量PCR 擴增，系統自動生成標準曲線。結果顯示，標準曲線在菌液濃度為5×102cfu/mL～108cfu/mL 時具有良好的線性相關性，低于5×102cfu/mL 時，雖仍有擴增(Ct=37～38)，但重復性和準確性差。Ct 值分析結果表明，不同濃度樣本平行樣的擴增曲線在閾值線附近基本重合(圖1)。以Ct 值為縱坐標(Y)，菌液濃度的對數為橫坐標(X)繪制標準曲線，曲線方程為y=-3.373x+44.562，回歸相關系數R2=0.998，擴增效率為97.9 %。結果表明，熒光定量PCR 法檢測下限為5×102cfu/mL。

圖1 沙門氏菌熒光定量PCR 靈敏度檢測Fig.1 Sensitivity test of real-time PCR for Salmonella

2.2.2 特異性試驗 分別以沙門氏菌參考菌株和其他非沙門氏菌菌株DNA 為模板，并以無DNA 模板為空白對照，進行熒光定量PCR 擴增。結果顯示，僅沙門氏菌參考菌株能擴增出良好的S 型曲線，其他菌株和空白對照均無S 型曲線(圖2)。

圖2 熒光定量PCR 法特異性驗證擴增曲線Fig.2 Real-time PCR specificity test curve of Salmonella

2.2.3 重復性試驗 采用沙門氏菌參考菌株培養液DNA 梯度稀釋樣本進行重復性試驗，結果顯示，3個濃度梯度樣本Ct 值的組內和組間變異系數(CV)均小于1 %，表明建立的熒光定量PCR 法檢驗飼料中沙門氏菌重復性和穩定性良好(表2)。

表2 熒光定量PCR 法重復性Table 2 Duplicability test of real-time PCR

2.3 不同增菌處理對熒光定量PCR法檢測結果影響 添加不同濃度沙門氏菌參考菌株樣本在增菌0 h、增菌18 h 和增菌42 h 后分別提取樣本DNA，熒光定量PCR 法檢測沙門氏菌。結果表明，增菌處理18 h 或24 h 的最低檢測限可達2×10-1cfu/mL，而增菌0 h 的最低檢測限為2×103cfu/mL(表3)。

表3 不同增菌處理熒光定量PCR 法檢測結果Table 3 Results of the real-time PCR by different enrichment methods

2.4 兩種檢測方法在飼料沙門氏菌檢測中的最低檢測限 通過對不同加標濃度樣本檢測證明，傳統培養法在飼料沙門氏菌檢測中的最低檢測限為2×101cfu/mL。熒光定量PCR 法在增菌和未增菌情況下的靈敏度不同：未增菌，直接提取添加樣本DNA 進行檢測，其最低檢測限為2×103cfu/mL，當細菌濃度低于2×103cfu/mL 時，雖仍有擴增(Ct=37～38)，但重復性和準確性差，且不同添加濃度樣本Ct 值接近，不能準確定量菌液濃度的拷貝數；經增菌(預增菌或增菌)后提取樣本DNA 進行檢測，最低檢測限均為2×10-1cfu/mL。

2.5 飼料樣本檢測結果 分別以傳統方法和熒光定量PCR 檢測72 份飼料樣本。傳統培養法陽性樣本為20 份，檢出率為27.8 %。以預增菌液提取DNA模板進行熒光定量PCR 檢測，陽性樣本為38 份，檢出率為52.8 %；以增菌液提取模板進行熒光定量PCR 檢測，陽性樣本為45 份，檢出率為62.5 %(表4)。熒光定量PCR 與傳統培養法符合率為65.3 %，且傳統培養法陽性樣本PCR 法檢測結果均為陽性。

表4 飼料樣本沙門氏菌檢測不同檢測方法陽性檢測結果Table 4 The positive reauLts of different method for determination of salmonella in feeds

3 討論

隨著分子生物學技術的迅猛發展，PCR 技術已越來越多應用到病原菌的檢測中，本研究以飼料樣本為研究對象，驗證熒光定量PCR 的適用性，試驗結果顯示該法檢測周期短(24 h)，靈敏度高，可作為飼料沙門氏菌檢測的備選方法。

沙門氏菌檢測方法主要有常規培養法，免疫法和分子生物學方法[7]。常規培養法操作繁瑣，周期長，已不適應日益發展的國際貿易需求；免疫法靈敏度雖高，能夠有效避免漏檢，但抗原抗體反應存在交叉反應，易產生假陽性。隨著分子生物學方法發展與成熟，現已有很多應用于病原菌檢測的研究[8-9]，其中定量PCR 法是在定性PCR 基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料，通過對PCR 擴增反應中每個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板的定量和定性分析，檢測不需要電泳，靈敏度更高。本研究采用特異性較好的探針法進行飼料沙門氏菌檢測的研究，并著重于飼料基質樣本適用性的評估，與大多數研究主要側重于目標基因的選擇、引物設計及反應條件優化等不同，對于實際應用應更有指導意義。

PCR 方法應用于病原菌檢測的缺點主要是該方法不能區分死菌和活菌[10]，而對于病原菌監控來說，只需要控制活菌，死亡的沙門氏菌并不會對畜禽食品安全構成威脅。本研究中，同批樣本在未采取增菌的情況下，無陽性樣本檢出，而傳統培養法和增菌PCR 法均有檢出，這是否代表飼料樣本的PCR檢測法可以忽略死菌的干擾，將進一步研究確定。

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