超級細菌blaNDM-1基因Taq Man-MGB熒光定量PCR檢測方法的建立

施開創，李鳳梅，張步嫻，黎宗強*，莫勝蘭，許心婷

(1.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005)

2009 年12 月，從一名印度裔瑞典病人尿路感染中首次分離到一株攜帶新德里金屬β-內酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1)、具有超強耐藥性的肺炎克雷伯菌[1]；隨后，從印度、巴基斯坦、英國等國家的病人分離到180 株以大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等為主的腸桿菌科細菌，它們攜帶編碼NDM-1 的blaNDM-1基因，除對替加環素和多粘菌素敏感外，對多種抗生素如β-內酰胺類、碳青霉烯類、大環內酯類、氨基糖苷類及喹諾酮類等均具有耐藥性[2]。這種耐藥“超級細菌”(Superbug)迄今已在巴爾干半島各國、美國、加拿大、荷蘭、中國等許多國家出現和流行，呈世界性分布[3-4]。

目前，blaNDM-1基因主要發現于腸桿菌科的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌以及不動桿菌屬的鮑曼不動桿菌等；其它一些細菌也可攜帶該基因，其中攜帶blaNDM-1基因的沙門氏菌已在美國、法國、中國等多個國家被發現[5]。當前，對blaNDM-1基因陽性菌的篩查主要采用表型篩查和基因檢測[6]。表型篩查包括E-test 法、改良Hodge 試驗、亞胺培南-EDTA 紙片協同試驗等[6]，但其存在耗時長、特異性差、靈敏度低等缺點?；驒z測具有快速、特異及敏感等優點，現已報道的檢測方法包括普通PCR、熒光定量PCR、LAMP、基因芯片技術等[7-9]。本研究針對blaNDM-1及其變異體基因序列的保守區域，設計一對特異性引物和一條MGB 探針，建立了檢測blaNDM-1基因的Taq Man-MGB 熒光定量PCR 方法，為監測攜帶blaNDM-1基因的動物源致病性超強耐藥菌提供了有效的技術手段。

1 材料和方法

1.1 菌 株 雞白痢沙門氏菌(CVCC538)、大腸桿菌(ATCC25922)、多殺性巴氏桿菌(CVCC386)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028)標準株均購自國家獸醫微生物菌種保藏中心。雞源致病性沙門氏菌34 株分離株由廣西動物疫病預防控制中心分離、鑒定和保存，應用ATB Expression 自動藥敏儀進行ATB VET藥敏試劑條(含28 種腸桿菌科常用抗菌藥物)藥敏試驗，表明這些分離株均為六重以上的耐藥菌[10]。

1.2 主要試劑 Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD18-T 載體、E.coli DH5α 感受態細胞、Hin d Ⅲ和Eco RⅠ內切酶、質粒DNA 提取試劑盒均購自TaKaRa 公司；產NDM-1 細菌檢測試劑盒購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 引物和探針的設計與合成 參考GenBank 中登錄的blaNDM-1基因(FN396876、AB604953、AB614355)及其變異體blaNDM-2～blaNDM-12基因序列(JF703135、JQ734687、JQ348841、JN104597、JQ235754、JX262694、AB744718、KC999080、KF361506、KP265940、AB926431)的保守區域，利用軟件Beacon Designer 7.9 設計1對特異性引物和1 條Taq Man-MGB 探針(表1)，由TaKaRa 公司合成。

表1 引物及探針序列Table 1 Sequences of primers and probe

1.4 重組質粒標準品的構建 根據blaNDM-1基因及其變異體blaNDM-2～blaNDM-12基因序列，選取一段長279 bp 的保守序列，由TaKaRa 公司通過體外合成單鏈DNA 小片段，再通過PCR 方法擴增該片段后，克隆至pMD18-T 載體中構建重組質粒pMD-NDM279。以重組質粒pMD-NDM279 為模板，利用引物bNDM 進行PCR 擴增，回收、純化擴增產物后克隆至pMD18-T 載體中，構建重組質粒pNDM-1，并經過測序鑒定，作為陽性標準品。測定其OD260nm/OD280nm值，計算質粒濃度，并根據公式換算成拷貝數：每μL 樣品中質粒的拷貝數=質粒濃度(ng/μL)×阿伏伽德羅常數×10-9/(660×質粒堿基數)。

1.5 熒光定量PCR反應條件的優化 以重組質粒pNDM-1 為模板，建立20 μL 反應體系，采用方陣法逐一對引物濃度(0.1 pmol/μL～0.6 pmol/μL)、MGB 探針濃度(0.2 pmol/μL～0.8 pmol/μL)、參比染料濃度(50×稀釋，用量0.2 μL～0.5 μL)、退火溫度(54 ℃～64 ℃)進行優化，以確定Taq Man-MGB 熒光定量PCR 的最佳反應條件。

1.6 標準曲線的制作 以10 倍系列稀釋成7 個濃度梯度的重組質粒(2.59×109拷貝/μL～2.59×103拷貝/μL)為模板，建立20 μL 反應體系，根據優化的反應條件，進行熒光定量PCR 擴增，生成標準曲線。

1.7 特異性試驗 以pNDM-1 及雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌標準株的基因組DNA 為模板，以無模板反應體系為陰性對照，應用建立的熒光定量PCR 方法進行檢測。

1.8 敏感性試驗 以10 倍系列稀釋的pNDM-1 作為模板，進行熒光定量PCR(模板分別為2.59×106拷貝/μL～2.59×100拷貝/μL 7 個梯度)和普通PCR(模板分別為2.59×109拷貝/μL～2.59×101拷貝/μL 9個梯度)擴增，確定其檢出下限。

1.9 重復性試驗 將10 倍系列稀釋的5 個濃度梯度(2.59×108拷貝/μL～2.59×104拷貝/μL)的pNDM-1 作為模板，進行熒光定量PCR 重復性試驗，分析其穩定性。進行組內重復性試驗時，每個稀釋度重復3 孔；進行組間重復性試驗時，同1 次反應每個稀釋度重復3 孔，重復3 次反應，間隔1周。

1.10 臨床樣品檢測 應用所建立的熒光定量PCR方法，對34 株雞源致病性沙門氏菌進行blaNDM-1基因的篩查，以評價該方法的實用性。

同時采用2010 年國家衛生部制定的《產NDM-1 泛耐藥腸桿科細菌感染診療指南（試行版）》中的雙紙片協同試驗，按照產NDM-1 細菌檢測試劑盒說明，進行細菌產NDM-1 的表型鑒定。將美洛培南(10 μg)紙片和滴加EDTA 的美洛培南(1 500 μg)紙片的抑菌圈直徑進行比較，兩者差值≥5 mm者為陽性，判定為細菌產NDM-1；兩者差值<5 mm者為陰性，判定為細菌不產NDM-1。最后將雙紙片協同試驗結果與熒光定量PCR 檢測結果進行比較，分析兩種方法的符合率。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的制備 以含有blaNDM-1基因279 bp 片段的重組質粒pMD-NDM279 為模板，采用特異性引物進行PCR 擴增，將其克隆至pMD18-T載體，構建重組質粒標準品pNDM-1。對其測序鑒定表明正確構建了blaNDM-1基因重組質粒標準品(圖1)。經測定，其濃度為79.989 μg/mL，換算成拷貝數為2.59×1010拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR最佳反應條件的確定 經過優化試驗，獲得最佳反應條件，確定Taq Man-MGB 熒光定量PCR 20 μL 反應體系為：Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)10 μL，Rox 參比染料(50×)0.5 μL，上下游引物bNDM-F(10 μM)、bNDM-R(10 μM)各0.5 μL，NDM-MGB 探針(10 μM)1.0 μL，pNDM-1質粒模板2.0 μL，滅菌雙蒸水5.5 μL。反應程序為：95 ℃20 s；95 ℃5 s、58 ℃20 s，40 個循環，同時收集熒光信號。

圖1 重組質粒pNDM-1 的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pNDM-1

2.3 標準曲線的制作 以7 個梯度的重組質粒標準品為模板，進行Taq Man-MGB 熒光定量PCR，繪制擴增曲線和標準曲線(圖2)。結果顯示，起始模板量與Ct 值之間存在良好的線性關系，相關系數R2達到0.999。

圖2 Taq Man-MGB 熒光定量PCR 的擴增曲線(A)及標準曲線(B)Fig.2 Dynamic curves(A)and standard curve(B)of the real-time PCR

2.4 特異性試驗結果 采用建立的熒光定量PCR方法分別以重組質粒pNDM-1 及雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌標準株的基因組DNA 為模板進行特異性試驗，結果顯示僅重組質粒標準品為陽性，其它細菌標準株及對照均為陰性，表明該方法具有良好的特異性(圖3)。

2.5 敏感性試驗結果 以2.59×106拷貝/μL～2.59×100拷貝/μL 7 個梯度的重組質粒pNDM-1 作為模板進行Taq Man-MGB 熒光定量PCR，結果顯示其檢出下限為2.59 拷貝/μL；以2.59×109拷貝/μL～2.59×101拷貝/μL 9 個梯度的重組質粒pNDM-1 作為模板進行普通PCR，結果顯示其檢出下限為2.59×102拷貝/μL。結果表明熒光定量PCR比普通PCR 敏感性高100 倍(圖4)。

圖3 Taq Man-MGB 熒光定量PCR 特異性試驗的擴增曲線Fig.3 Dynamic curves of the real-time PCR for specificity detection

圖4 Taq Man-MGB 熒光定量PCR 與普通PCR 敏感性試驗Fig.4 Sensitivity tests of the real-time PCR(A)and conventional PCR(B)

2.6 重復性試驗結果 以5 個濃度梯度的重組質粒pNDM-1 為模板，進行重復性試驗，結果顯示組內及組間重復性試驗的變異系數為0.35 %～1.20 %，均小于1.5 %(表2)，表明所建立的熒光定量PCR方法重復性良好。

2.7 臨床樣品檢測 應用所建立的熒光定量PCR對34 株于2013 年～2015 年采自廣西的雞源致病性沙門氏菌分離株進行blaNDM-1基因篩選，結果顯示未能檢測到攜帶blaNDM-1基因的沙門氏菌分離株。

應用雙紙片協同試驗對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌標準株以及34 株雞源致病性沙門氏菌分離株進行耐藥表型檢測，結果顯示，所有細菌對美洛培南和復合美洛培南的抑菌圈直徑的相差值均為小于5 mm，判定為陰性，不產生NDM-1。將雙紙片協同試驗與Taq Man-MGB 熒光定量PCR 的結果進行比較，兩者的符合率為100 %。

表2 Taq Man-MGB 熒光定量PCR 的重復性分析Table 2 Reproducibility assay of Taq Man-MGB real-time PCR

3 討論

除了blaNDM-1基因，迄今還發現其變異體blaNDM-2～blaNDM-12，它們之間核苷酸序列同源性很高，僅存在個別堿基位點的差異[4]。blaNDM-1～blaNDM-12基因位于細菌內部的質粒上，可通過接合作用水平傳播，將其超強耐藥性向同種和不同種細菌擴散[2]，使其它細菌種類攜帶blaNDM-1基因，對畜牧業和公共衛生安全造成嚴重威脅[5]。加強對攜帶blaNDM-1基因耐藥細菌的監測，對及早發現超強耐藥菌并防止其傳播擴散意義重大。

迄今，所發現攜帶blaNDM-1基因的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、沙門氏菌等主要來自病人及環境樣本，極少來自動物[5]。在我國，Wang等2012 年首次報道從雞源洛菲不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)中檢測到blaNDM-1基因[11]；溫肖會等[12]應用PCR 方法對分離自動物及環境的229 株大腸桿菌、31 株鏈球菌進行檢測，未發現攜帶blaNDM-1基因的分離株。沙門氏菌是重要的人畜共患病原菌，近年來出現嚴重的耐藥及多重耐藥現象[13]，我國已從病人中分離到攜帶blaNDM-1基因的沙門氏菌[14]，但未見來自動物的報道。

本研究針對blaNDM-1基因及其變異體blaNDM-2～blaNDM-12基因序列的保守區域，設計特異性引物和Taq Man-MGB 探針，經過優化反應條件，建立了特異性強、敏感性高、重復性好的blaNDM-1基因Taq Man-MGB 熒光定量PCR 方法，可以用于快速檢測blaNDM-1基因及其變異體blaNDM-2～blaNDM-12基因。

2013 年～2015 年，從廣西各地分離鑒定了34株雞源致病性沙門氏菌，藥敏試驗表明這些分離株多重耐藥嚴重，均為6 重耐藥以上[10]。本研究應用所建立的Taq Man-MGB 熒光定量PCR 方法對這34株致病性沙門氏菌分離株進行檢測，未能檢測到攜帶blaNDM-1基因的分離株，表明目前廣西養雞場存在攜帶blaNDM-1基因“超級細菌”的幾率較低。但由于養殖環節不合理使用甚至濫用抗菌藥物極為嚴重，應予高度重視，不斷擴大監測面，建立有效的防控措施。

動物致病性細菌的耐藥問題日益嚴峻，必須加強監測和防范，以確保畜牧業健康發展和公共衛生安全。本研究建立的blaNDM-1基因Taq Man-MGB 熒光定量PCR 方法具有特異性強、敏感性高、重復性好的特點，為監測攜帶blaNDM-1基因及其變異體blaNDM-2～blaNDM-12基因的超級細菌提供了有效的技術手段。

[1]Yong D,Toleman M A,Giske C G,et al.Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene,blaNDM-1,and a novel erythromycin estsrase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumonia sequence type 14 from India[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(12):5046-5054.

[2]Kumarasamy K K,Toleman M A,Walsh T R,et al.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India,Pakistan,and the UK:a molecular,biological,and epidemiological study[J].Lancet Infect Dis,2010,10(9):597-602.

[3]Berrazeg M,Diene S,Medjahed L,et al.New Delhi Metallobeta-lactamase around the world:an eReview using Google Maps[J].Euro Surveill,2014,19(20):20809.

[4]Dortet L,Poirel L,Nordmann P.Worldwide dissemination of the NDM-type carbapenemases in Gram-negative bacteria[J].Biomed Res Int,2014,2014:249856.

[5]Wailan A M,Paterson D L.The spread and acquisition of NDM-1:a multifactorial problem[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(1):91-115.

[6]Nordmann P,Poirel L,Carrer A,et al.How to detect NDM-1 producers[J].J Clin Microbiol,2011,49(2):718-721.

[7]Huang Li,Hu Xiu-mei,Zhou Man,et al.Rapid detection of New Delhigene and variants coding forcarbapenemases with different activities by use of a PCR-based in vitro protein expression method[J].J Clin Microbiol,2014,52(6):1947-1953.

[8]Solanki R,Vanjari L,Ede N,et al.Evaluation of LAMP assay using phenotypic tests and conventional PCR for detection of blaNDM-1and bla KPC genes among carbapenem-resistant clinical Gram-negative isolates[J].J Med Microbiol,2013,62(Pt 10):1540-1544.

[9]Cuzon G,Naas T,Bogaerts P,et al.Evaluation of a DNA microarray for the rapid detection of extended-spectrum β-lactamases(TEM,SHV and CTX-M),plasmid-mediated cephalosporinases(CMY-2-like,DHA,FOX,ACC-1,ACT/MIR and CMY-1-like/MOX)and carbapenemases(KPC,OXA-48,VIM,IMP and NDM)[J].J Antimicrob Chem,2012,67(8):1865-1869.

[10]施開創，李鳳梅，鄒聯斌，等.雞源致病性沙門氏菌的分離鑒定及血清型和藥物敏感性分析[J].中國畜牧獸醫，2015，42(8)：2160-2168.

[11]Wang Yang,Wu Cong-ming,Zhang Qi-jing,et al.Identification of New Delhi metallo-β-lactamase 1 in Acinetobacter lwoffii of food animal origin[J].PLoS one,2012,7(5):e37152.

[12]溫肖會，翟少倫，邱婷，等.細菌blaNDM-1基因PCR 檢測方法的建立及應用[J].動物醫學進展，2013，34(12)：145-149.

[13]劉芳萍，趙玉林，李昌文，等.雞源性沙門氏菌耐藥基因檢測與耐藥相關性分析[J].中國預防獸醫學報，2013，35(8)：627-630.

[14]Huang Jin-wei,Wang Ming-hua,Ding Hui,et al.New Delhi metallo-β-lactamase-1 in carbapenem-resistant Salmonella strain,China[J].Emerg Infect Dis,2013,19(12):2049-2051.