G2系和G5系雞感染馬立克氏病毒早期細胞因子轉錄水平的變化

蔡文博，吳少蓮，彭蔚宇，王麗廷,3，陳洪巖，韓凌霞*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/實驗動物與比較醫學團隊，黑龍江哈爾濱 150001；2.常州市金壇區動物疫病預防控制中心，江蘇常州 213200；3.山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801)

馬立克氏病(Marek's disease，MD)是由馬立克氏病毒(MDV)引起的一種雞惡性淋巴組織增生性疾病。不同主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex，MHC)B 單倍型雞對感染MD 有遺傳學抗性和免疫學差異[1-2]。

G2 系和G5 系雞群是國家禽類實驗動物種子中心培育、保存的兩個無特定病原體(SPF)雞品系，分別具有B15 和B5 單倍型特征[1,3]。MD 疫苗對B5 和B21 單倍型雞的保護力不同，對B15 的保護力強于B2 和B13[1]，但MDV 對B15 和B5 單倍型雞的致病性及引起的免疫反應差異還未見詳細報道。本實驗室前期研究中曾揭示14 日齡～35 日齡健康G2 和G5 系雞肺淋巴細胞、脾臟和外周血淋巴細胞(PBL)中IFN-γ、IL-18、IL-4 和IL-104 種細胞因子的轉錄水平存在差異[4]。Th1 型和Th2 型細胞因子在包括G2 和G5 系在內的70 日齡MHC B 單倍型雞的初級免疫器官中呈高水平轉錄，并且相互制衡，例如胸腺中IFN-γ 和IL-4 相互平衡，法氏囊中為IL-18 與IL-10[5]。B19 和B21 單倍型雞腹腔接種超強毒MDV(vvMDV)后第4 d、7 d、10 d、13 d，IFN-γ、IL-18、IL-4 和IL-10 的轉錄水平表現出不同的動態趨勢[6]。機體天然免疫應答在病毒感染的第一時刻發揮作用，并影響病程的轉歸。本實驗模擬自然感染途徑，對G2 和G5 系SPF 雞接種MDV，研究感染立即早期肺淋巴細胞、脾臟和PBL 中病毒致瘤基因meq 及IFN-γ、IL-18、IL-4 和IL-10 的轉錄水平，為揭示MD 的天然免疫機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 病毒株、重組質粒及實驗動物 vvMDV Md5株、含有MDV meq 基因的重組質粒pMD-M 由哈爾濱獸醫研究所禽病室劉長軍副研究員饋贈。分別含有IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-18 和28S rRNA 基因的重組質粒p-IFN-γ、p-IL-4、p-IL-10、p-IL-18、p-28s rRNA 由本實驗室制備保存[5]。白來航系列G2 系和G5 系SPF 雞由本研究所實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 雞淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；RNA Isoplus、M-MLV反轉錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTP Mixture(10 mmol/L)、Premix Ex TaqTM等購自TaKaRa 公司；質粒小量提取試劑盒購自Omega 公司。

1.3 引物、探針的合成及標準曲線的構建 分別以meq、雞IFN-γ、IL-4、IL-10 和IL-18 為檢測靶基因，以28S rRNA 為內參基因，建立雙重熒光定量RT-PCR(dqRT-PCR)方法。meq、IFN-γ、IL-18、IL-4、IL-10 和28S rRNA 的引物及熒光素標記探針參照文獻設計合成[7-8]，除28S rRNA 探針的5' 端用熒光素HEX 標記外，其余均采用FAM，所有探針的3' 端淬滅基團均為BHQ1。引物和探針由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。按照之前建立的方法構建標準曲線[5]。使用Bio/Rad IQ5 定量PCR儀進行擴增。

1.4 動物接種實驗 將24 羽G2 系和24 羽G5 系14 日齡SPF 雛雞，分為感染組和對照組，不分雌雄，各12 羽。感染組滴鼻接種MDV Md5 株細胞毒，每羽2 000 pfu(0.2 mL)，對照組接種等量無菌PBS。接種后4 h、24 h、48 h 和96 h 感染組和對照組分別各取3 只，采集翅靜脈肝素鈉抗凝血、肺臟(從喉頭至兩個完整肺臟)和脾臟。

1.5 病毒及細胞因子mRNA定量檢測 按照雞淋巴細胞分離液說明書分離PBL；將肺臟置于預冷的PBS 中洗滌，剪碎，采用注射器尾部在200 目銅網上研磨，分散成單細胞，按照分離PBL 的方法分離淋巴細胞；將脾臟剪碎，采用研磨棒充分研磨。分別提取各組織總RNA，經反轉錄得到cDNA，按照之前建立的方法[5]，利用dqRT-PCR 檢測MDV meq、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-18 的mRNA 相對含量。利用SAS 軟件中的LSD 法進行數據分析。

2 結果

2.1 MDV轉錄水平的比較 G2 和G5 系雞群感染MDV 后96 h，在肺淋巴細胞和脾臟中檢測到MDV meq 的mRNA，而且肺淋巴細胞中的含量高于脾臟。G2 系雞群肺淋巴細胞中的病毒mRNA 含量高于G5，脾臟中低于G5，但均無統計學意義(圖1)。在PBL 中始終未檢測到。對照組未檢出。

2.2 IFN-γ 轉錄水平的比較 感染MDV 后雞肺淋巴細胞中IFN-γ 轉錄水平比對照組持續明顯升高，96 h G2 系升高5 170 倍，G5 系升高3 330 倍(圖2A)，脾臟中始終高于對照組(圖2B)，PBL 中一直處于較低水平(圖2C)。

2.3 IL-18轉錄水平的比較 感染MDV 后，雞肺淋巴細胞(圖3A)和PBL 中(圖3C)IL-18 轉錄水平與對照組相當，G2 系感染組脾臟中IL-18 轉錄水平始終高于G5(圖3B)。

圖1 病毒轉錄水平的動態變化Fig.1 MDV transcript levels

圖2 IFN-γ 轉錄水平的動態變化Fig.2 IFN-γ transcript levels

圖3 IL-18 轉錄水平的動態變化Fig.3 IL-18 transcript levels

2.4 IL-4轉錄水平的比較 感染MDV 后96 h G2和G5 系肺淋巴細胞及脾臟中IL-4 轉錄水平急劇上升，均明顯高于對照組(圖4)。

圖4 IL-4 轉錄水平的動態變化Fig.4 IL-4 transcript levels

2.5 IL-10轉錄水平的比較 感染96 h 后肺淋巴細胞中IL-10 轉錄水平大幅升高，G2 高于G5(圖5A)，G2 系和G5 系脾臟中表現出不同的動態變化(圖5B)，PBL 中IL-10 轉錄水平始終低于對照組(圖5C)。

圖5 IL-10 轉錄水平的動態變化Fig.5 IL-10 transcript levels

3 討論

呼吸道粘膜系統是MDV 侵入雞的重要途徑，自然環境下雞通過吸入吸附有病毒的粉塵或塵埃而發生感染，病毒感染過程的立即早期階段，機體的細胞免疫應答水平和類型是影響病程轉歸的重要因素。前期研究結果表明，MHC B 單倍型雞不同組織器官中的多種細胞因子轉錄水平受日齡、病程以及品系的影響[6]。

給雞利用吹入方式感染MDV 的粉塵后，易感雞和抗性雞的肺臟分別于感染后2 d 和3 d 檢測到病毒基因的轉錄，而脾臟是在3 d 和4 d[9]。本實驗為模擬自然感染途徑，在參考了Davidson 和Borenshtain 用點眼和經口接種的方式基礎上，選擇了滴鼻感染[10]。結果在感染后96 h，在肺和脾臟中檢測到病毒的轉錄，但G2 系肺中的病毒轉錄快于G5系，脾臟中低于G5 系，暗示病毒粒子在G2 系雞可能較快適應并起始復制，但在之后與機體免疫系統的抗衡遭到較大阻力。

IFN-γ 被轉錄激活是感染病毒的典型特征。IFN-γ 通過位于iNOS 基因上游調控元件激活iNOS的轉錄，增加Mφ 中iNOS 的含量，催化NO 的產生，從而抑制MDV 的復制[2]?？剐噪u肺臟比易感雞更早誘導IFN-γ[9]，其高水平轉錄可以更快地使MD從溶細胞感染進入潛伏期[11]。感染強毒株MDV 后，抗性雞和易感雞脾細胞中IFN-γ 轉錄升高程度無顯著性差異[12]，而感染超強毒后，前者轉錄水平顯著高于后者[13]。本實驗感染vvMDV 后，G2 系和G5系肺淋巴細胞(48 h)和脾臟(96 h)中IFN-γ 轉錄水平升高，G2 系高于G5 系，與文獻報道的結果一致[11]。Quere 等人發現，抗性雞感染MDV 早期外周血中IFN-γ 的mRNA 含量少量增多，易感雞無變化[14]。96 h 后G2 系攻毒組肺淋巴細胞、脾臟和PBL 中IFN-γ 轉錄水平均高于G5 系，可能說明G2 系對MD 的抵抗能力相對強于G5 系。

IFN-γ 與IL-18 等促炎細胞因子存在相互促進作用[9]。本實驗中G2 系感染組肺和脾臟中IL-18 轉錄水平均高于G5，可能與IFN-γ 的分泌有關。文獻報道感染強毒株JM-16 后，易感雞和抗性雞脾細胞中IL-18 轉錄水平相當[12]。

感染96 h 后兩品系雞肺淋巴細胞和脾臟中IL-4和IL-10 轉錄水平均升高，與文獻報道其他品系雞感染5 d 后脾臟中IL-4 和IL-10 轉錄水平上調以及96 h 后脾臟CD4+T 細胞和CD8+T 細胞中IL-10 轉錄水平上調的結果一致[12,15]。IL-4 和IL-10 轉錄水平上調是Th2 型免疫反應的標志[15]，通過阻止IFN-γ等Th1 型細胞因子的分泌抑制Th1 型免疫反應。

相信了解不同MHC 單倍型雞感染MDV 后立即早期的細胞免疫應答變化，對闡明MD 感染的免疫遺傳相關性具有重要的提示意義。G2 和G5 系雞是根據MHC 單倍型在SPF 白來航雞的基礎上選育出來的，本研究結果提示G2 系對MDV 的抵抗能力強于G5 系，這兩種品系雞感染MDV 后可能主要啟動以Th2 型為主的細胞免疫反應，為研究MDV 對不同MHC 單倍型雞的致病性提供了實驗依據。

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