安徽地區豬傳染性胸膜肺炎流行病學調查

施 雷，李 郁，魏建忠，耿照玉，殷宗俊，顧秋成，王海洋，李好磊，郭志英，孫 裴

(安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoiae，APP)引起的一種嚴重的豬呼吸系統接觸性傳染病[1-2]，以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征[3]。急性PCP 能夠引起病豬高熱、呼吸困難、食欲不振，病死率高；慢性PCP 病死率雖低，但會嚴重影響豬的生產和繁殖性能，降低飼料轉化率、延遲育肥豬出欄時間、減少母豬產仔數、降低仔豬成活率[4]。

1957 年Pattison 等首次報道PCP，1990 年楊旭夫等證實該病在我國的存在，為引起豬呼吸道疾病綜合征的主要原因之一，給我國養豬業造成嚴重的經濟損失[5]。為了解安徽地區豬群PCP 的感染情況，本調查采用的ApxIV-ELISA 抗體檢測試劑盒的包被抗原ApxIV 具有很強的種屬特異性，并且該抗原僅在APP 感染豬體內產生[6]，采用該試劑盒對采自安徽省13 個地市的1 288 份豬血清樣品進行APP 感染抗體檢測；同時利用PCR 方法，對573 份母豬鼻腔棉拭子樣品、92 份屠宰生豬肺臟樣品進行APP 核酸檢測，為進一步制定PCP 的有效防控措施提供相關依據。

1 材料和方法

1.1 菌株及臨床樣品來源 APP 參考菌株1 株、金黃色葡萄球菌(S.aureus)1 株、大腸桿菌(E.coli)1 株、豬鏈球菌(S.suis)2 株、豬霍亂沙門氏菌(S.suipestifer)2 株、豬紅斑丹毒絲菌(E.rhusiopathiae)2 株、副豬嗜血桿菌(H.parasuis)2 株、多殺性巴氏桿菌(P.multocida)2 株均由安徽農業大學動物科技學院動物傳染病研究室保存。2014 年5 月～2015 年4 月，采集1 288 份來自安徽省淮北、江淮和皖南地區，13 個地市不同規?；i場不同生產階段豬及屠宰生豬的血清樣品，以及573 份來自13 個規?；i場的母豬鼻腔棉拭子樣品和92 份屠宰生豬肺臟樣品。

1.2 主要試劑 ApxIV-ELISA 抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；2×Taq MasterMix、DNA Marker DL600、NAD 購自天根生化科技(北京)有限公司；TSB 購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 引物設計及合成 參考文獻[4]設計引物，序列如下：5'-GATAAACCTTTTCCGGAATT-3'/5'-TAC CACACCGTGTTTATCAA-3'，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 APP感染抗體的檢測 將采集的1 288 份血清樣品，按照ApxIV-ELISA 抗體檢測試劑盒說明書進行感染抗體檢測。試驗成立條件：陽性對照孔OD630nm值均≥0.6；陰性對照孔OD630nm值均<0.3。如果S(樣品孔OD630nm值)≥P(陰性對照孔平均OD630nm值)×0.25，判為陽性；如果S

1.5 PCR方法檢測APP核酸 參照文獻[6]，將無菌采集的鼻腔分泌物和肺臟組織樣品小塊放入裝有1 mL TSB 肉湯(添加1 % NAD)的EP 管中，37 ℃200 r/min 增菌2 h。取500 μL 上述培養物提取細菌DNA，具體操作為12 000 r/min 離心10 min 后棄上清，ddH2O 重懸，反復凍融3 次，12 000 r/min 離心10 min 后取上清即可。PCR 反應體系25 μL，包括12.5 μL 2×Taq MasterMix，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，5 μL DNA 模板，5.5 μL ddH2O。反應條件為：95 ℃5 min；95 ℃45 s、57 ℃2 min、72 ℃1 min，共3 個循環；95 ℃20 s、57 ℃1 min、72 ℃1 min，共30 個循環；72 ℃10 min。PCR 產物經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 統計學分析 采用Excel 2003 及SAS 9.0 軟件進行統計學分析，各組數據間比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 血清APP感染抗體檢測結果 利用ApxIVELISA 抗體檢測試劑盒對1 288 份血清樣品進行檢測，結果顯示，共有340 份APP 感染抗體檢測為陽性，檢測樣品總陽性率為26.40 %(340/1 288)。

2.1.1 不同地區豬群血清中APP 抗體檢測結果 對不同地區豬群血清樣品中APP 抗體進行檢測，結果顯示江淮地區(28.57 %)和淮北地區(30.73 %)的APP感染抗體陽性檢出率與皖南地區相比差異顯著，皖南地區最低，為13.77 %(表1)。

2.1.2 不同季節豬群血清中APP 抗體檢測結果 對不同季節豬群血清中APP 抗體進行檢測，結果顯示夏季APP 感染抗體陽性檢出率最高，為41.42 %，與春季(29.75 %)、秋季(26.35 %)、冬季(19.26 %)相比差異顯著(表2)。

2.1.3 不同生長階段豬群血清中APP 抗體檢測結果對不同生長階段豬群血清中APP 抗體進行檢測，結果顯示母豬/后備母豬/公豬APP 感染抗體陽性檢出率最高，為45.47 %，與哺乳仔豬(28.02 %)、保育豬(6.16 %)、育肥豬(7.20 %)相比差異顯著(表3)。

表1 不同地區血清APP 抗體檢測結果Table 1 The antibody against APP detected in pig serum in different regions

表2 不同季節血清APP 抗體檢測結果Table 2 The antibody against APP detected in pig serum in different seasons

表3 不同生長階段豬群血清APP 抗體檢測結果Table 3 The antibodies against APP in serum detected in pigs with different ages

2.1.4 不同規模豬場豬群血清中APP 抗體檢測結果對不同規模豬場豬群血清中APP 抗體進行檢測，結果顯示存欄100 頭～500 母豬的中型豬場APP 感染抗體陽性檢出率最高，為47.16 %，與存欄500 頭以上母豬的大型豬場(19.28 %)和存欄100 頭以下母豬的小型豬場及散養戶(23.15 %)相比差異顯著(表4)。

2.2 APP核酸檢測結果 分別對573 份母豬鼻腔棉拭子樣品和92 份屠宰生豬肺臟樣品APP 核酸進行PCR 檢測，結果顯示均有11 份經PCR 擴增獲得目的片段。母豬鼻腔棉拭子APP 核酸陽性檢出率為1.92 %，與屠宰生豬肺臟樣品陽性檢出率(11.96 %)相比差異顯著。

2.3 ELISA與PCR同步檢測結果的比較 采用PCR 方法對665 份鼻拭子及肺臟樣品進行APP 核酸檢測，結果顯示陽性率為3.31 %；同時采用ELISA試劑盒對665 份相應的血清樣品進行APP 感染抗體檢測，陽性率為52.33 %，兩者符合率為49.77 %(331/665)(表5)。

表4 不同規模豬場血清APP 抗體檢測結果Table 4 Test results of antibody against APP in serum in different scale of farms

表5 ELISA 與PCR 同步檢測結果的比較Table 5 The comparison of ELISA and PCR detection results

3 討論

近年來，由于我國頻繁引種，PCP 也隨之侵入，其發生和流行日趨嚴重。采用間接血凝試驗對APP檢測結果顯示，國內9 個省市(河南、北京、湖北、寧夏、青海、湖南、江西、福建和四川)APP 抗體陽性率為18.55 %～87.95 %[7]。本調查顯示安徽省13 個地市1 288 份豬血清樣品APP 感染抗體陽性檢出率為26.40 %，與其他省份相比，處于相對中等水平的感染狀態，但安徽省周邊地區，特別是福建(87.95%)和江西(78.21 %)豬群APP 感染水平較高[7]，對安徽養豬業已構成潛在威脅，應引起足夠的重視。

安徽地區母豬/后備母豬/公豬APP 感染抗體陽性率高于其他生長階段，與龔云登等[8]的報道一致，這與母豬/后備母豬/公豬飼養時間較長、接觸病原菌機率較多、妊娠分娩造成應激等因素有關。同時哺乳仔豬APP 感染抗體陽性率高于保育豬和育肥豬，分析原因，一方面，哺乳仔豬抗體源于母源抗體[9]；另一方面，哺乳仔豬與高PCP 感染率的母豬群長期直接接觸，從而產生感染抗體。傅彩霞等報道PCP 多發于春冬季節，夏季較為少見[10]，而王偉等報道PCP 在夏季高發[11]。本研究結果顯示安徽地區夏季抗體陽性率高于其他季節，原因是安徽夏季炎熱，降雨量大，造成豬場夏季酷熱并且濕度大，豬體免疫力下降，感染壓力增大。皖南地區感染情況比淮北和江淮輕微，原因是皖南多為山區，養殖規模小，生豬流動性相對較低。Willson 等報道PCP 感染率與飼養規模呈正相關[12]，本調查顯示安徽地區中型豬場抗體陽性率高于其他規模場，這是由于中型豬場相對小型豬場及散養戶飼養密度大，較易出現大規模感染。此外，中型豬場相對大型豬場多數沒有采取自繁自養的飼養模式，配套設施不完善，免疫程序不成熟，飼養管理不到位，不能有效控制該病的發生。

Jacobsen 等研究表明APP 可以長期存在于感染豬的肺臟和扁桃體中，極少數情況下鼻腔中也可被檢出[13]。安徽地區豬場母豬群和商品豬群均有APP帶菌現象，母豬鼻腔棉拭子樣品的APP 核酸檢出率低于屠宰生豬肺臟樣品，而APP 感染抗體檢測結果顯示母豬APP 感染情況比屠宰生豬嚴重，表明鼻腔帶菌的情況不常發生。ELISA 試劑盒與PCR 同步檢測結果顯示兩者符合率偏低，抗體陽性檢出率高于核酸?？赡苁怯捎诩毦鷶盗吭谧陨砻庖呦到y和抗生素的作用下減少，并且PCR 模板中含有大量其他微生物核酸等抑制成分[4]。同時，感染抗體檢出率比細菌本身要高[14]。因此，檢測感染抗體對于監測和控制該病更有意義。

PCP 在安徽地區豬群中普遍存在，已成為導致豬呼吸道疾病的主要病因之一。豬場可以通過實施疫苗免疫接種、改善飼養管理、定期進行全群監測、淘汰帶毒豬、培育陰性健康種群等凈化措施，有效控制該病的發生和流行。由于APP 有15 種血清型，不同血清型之間具有交叉反應并且毒力差異大[15]，本調查后續將對安徽地區主要流行菌株進行分離鑒定和篩選，為豬場APP 疫苗免疫提供參考依據，為APP 新型疫苗的研發提供種子菌株。

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