以CotB為分子載體表面展示雞白痢沙門氏菌OmpC的重組枯草桿菌芽孢對小鼠免疫效果的研究

劉明剛，戴茜茜，徐毓琴，張飛燕，唐慧琴，潘康成,2*

(1.四川農業大學 動物醫學院/動物微生態研究中心，四川 成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

沙門氏菌感染是一類極其重要的傳染病，目前疫苗接種仍是實踐中抗沙門氏菌感染的主要措施。但由于沙門氏菌減毒活疫苗或者滅活全菌疫苗存在脂多糖不良反應、免疫持續期短、毒力返祖風險以及沙門氏菌血清型復雜且各血清型之間不能提供交叉保護等限制了疫苗的應用[1-3]。因此，以沙門氏菌某些確切、無毒副作用的成份制備亞單位疫苗的研究受到關注[2,4]。沙門氏菌外膜蛋白存在一個孔形成蛋白家族，稱為孔蛋白[5]。在眾多孔蛋白中，外膜蛋白C(Outer membrane protein C，OmpC)為攜帶獨特外露表位的主要表面抗原，能夠誘導機體產生高水平的抗OmpC 抗體，并可以加強細胞介導的保護性免疫反應，為機體提供抗沙門氏菌感染的保護性免疫反應。同時不同血清型沙門氏菌中ompC 基因具有高度保守性，使其在疫苗研制方面具有重要應用潛力[5-7]?？莶菅挎邨U菌芽孢展示系統憑借其出色的安全性與穩定性廣泛應用于抗原等其他生物活性分子表面展現與遞送等[8-9]。在構成芽孢衣殼蛋白的多肽中，CotB(Coat protein B)由于更接近芽孢表面，因此更適宜作為載體將外源蛋白，尤其是疫苗抗原展現于芽孢表面，通過斑點免疫印跡研究表明，當以CotB 作為分子載體時，每個芽孢可表達約1×103重組分子，同時芽孢衣殼蛋白由枯草芽孢桿菌母細胞產生，并在芽孢的形成過程中在母細胞的細胞質中進行組裝，因此不受分泌信號與跨膜轉運的束縛[8-9]。因此，本實驗通過對小鼠口服給予本實驗室構建以CotB 為分子載體表面展示雞白痢沙門氏菌外膜蛋白OmpC 的重組枯草芽孢桿菌SE1 芽孢，研究其免疫效果，為開發新型雞白痢沙門氏菌口服疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株及實驗動物 雞白痢沙門氏菌CVCC533和鼠傷寒沙門氏菌SL1344 購自中國獸醫藥品監察所；重組枯草芽孢桿菌SE1(168ΔamyE::cotB-ompC)由本中心保存與構建；野生型枯草芽孢桿菌168 由本中心保存。5 周齡SPF 級的雌性昆明小鼠(體質量23.0±2.0 g)購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG(IgG-HRP)與羊抗鼠IgA 購自Santa Cruz Biotechnology；高吸附96 孔平底聚苯乙烯酶標板和EL-TMB顯色試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 枯草芽孢桿菌芽孢制備 通過營養耗盡法[10]進行重組枯草芽孢桿菌SE1 與野生型枯草芽孢桿菌168 的芽孢制備，培養物65 ℃水浴處理1 h，殺死殘余營養型細胞，芽孢化懸液經離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)收集沉淀，去離子水重懸沉淀，調整芽孢濃度為5×1010cfu/mL，-20 ℃保存備用。

1.4 實驗設計 120 只5 周齡SPF 級的雌性昆明小鼠(體質量23.0±2.0 g)預飼適應期結束后，隨機分為5 組，每組24 只，按照表1 實驗設計進行處理，A組與B 組在試驗的第0、15 d 分別兩次灌服重組枯草芽孢桿菌SE1 與野生型枯草芽孢桿菌168 的芽孢，每次每只灌服量為200 μL，含芽孢1.0×1010cfu；C 組與D 則將重組枯草芽孢桿菌SE1 與野生型枯草芽孢桿菌168 的芽孢拌料飼喂小鼠，每克飼料含1.0×106cfu 芽孢。G 組為非免疫組，僅飼喂基礎日糧；所有動物實驗程序按照中國疾病預防控制中心關于實驗動物福利與使用指導進行。

1.5 小鼠血清IgG及腸粘膜SIgA抗體水平的檢測

1.5.1 間接ELISA 包被抗原制備 雞白痢沙門氏菌CVCC533 活化后，挑取單菌落接種于100 mL 營養肉湯中，37 ℃160 r/min 振蕩培養16 h，平板活菌計數并用PBS(pH7.4)調整細菌濃度為4×109cfu/mL。

表1 實驗設計Table 1 Experimental design

1.5.2 抗體檢測樣品的采集 在試驗前1 d 與試驗第22 d 時，每組隨機選取4 只小鼠進行眼眶采血，室溫與4 ℃條件下分別靜置2 h 后離心收集血清(4 ℃，2 500 r/min，10 min)，-20 ℃保存。采血后的小鼠頸椎脫臼迫殺，無菌剖取小腸，向腸腔內注入預冷的0.5 mL PBS，輕輕晃動腸段2 min 后收集內容物，4 ℃4 500 r/min 離心10 min 收集上清液，-20 ℃保存。

1.5.3 免疫小鼠抗體水平的檢測 采用包被液0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋熱滅活后的雞白痢沙門氏菌菌液至1×109cfu/mL，參照文獻方法進行全細胞間接ELISA 法檢測樣品血清IgG 與小腸內容物SIgA 水平[11]。統計樣品的P/N 值即免疫前后樣品ELISA OD450nm值間的比值，當P/N≥2.1 判為陽性，表明產生具有保護作用的抗體，而當1.5≤P/N<2.1則判為可疑，P/N<1.5 為陰性，未產生保護性抗體。

1.6 鼠傷寒沙門氏菌SL1344 LD50測定 參照文獻[12]的方法，測定鼠傷寒沙門氏菌SL1344 對小鼠的LD50。保存的鼠傷寒沙門氏菌SL1344 經活化后，挑取單菌落接種于50 mL 營養肉湯中，37 ℃160 r/min振蕩培養16 h，5 000 r/min 離心5 min，收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌3 次，重懸菌體。采用平板活菌計數法檢測細菌濃度，并調整細菌濃度為4×109cfu/mL、4×108cfu/mL、4×107cfu/mL 與4×106cfu/mL。取32 只5 周齡SPF 級的昆明小鼠，隨機分為4組，每組8 只，每組小鼠分別腹腔注射0.5 mL 上述4 個濃度的鼠傷寒沙門氏菌SL1344 菌液，觀察72 h，記錄死亡率與存活率，計算LD50。

1.7 重組芽孢抗鼠傷寒沙門氏菌感染交叉保護作用方法1.4 中的小鼠飼喂至第22 d 時，每組隨機取16只，各分成2 組，一組腹腔注射2×LD50/只的鼠傷寒沙門氏菌SL1344，另一組腹腔注射10×LD50/只的鼠傷寒沙門氏菌SL1344，觀察72 h，記錄發病與死亡情況。

1.8 數據統計 采用SPSS 統計處理軟件(Version 20.0)對實驗數據進行分析。

2 結果

2.1 免疫小鼠血清IgG及腸粘膜SIgA水平檢測結果 將雞白痢沙門氏菌CVCC533 全菌作為包被抗原，對免疫前1 d 與試驗第22 d 的各組小鼠OmpC特異性血清IgG 與腸粘膜SIgA 抗體水平進行ELISA檢測，結果顯示，兩種方式口服重組芽孢組(A 組與C 組)血清IgG 與粘膜SIgA 的P/N≥2.1，而對照組(B、D 與E 組)P/N<1.5；口服重組芽孢組所誘導的血清IgG 與粘膜SIgA 的P/N 值較3 個非重組芽孢組差異均極顯著(p<0.01)；拌料飼喂給予重組芽孢組(C 組)P/N 值顯著高于灌胃給予重組芽孢組(A 組)(p<0.05)(表2)。結果表明，口服給予小鼠重組芽孢可以誘導產生血清IgG 和腸道粘膜SIgA，其中拌料飼喂所誘導產生的免疫保護抗體水平優于灌服。

表2 口服重組芽孢前后小鼠血清IgG 與腸粘膜SIgA 水平Table 2 Serum IgG and intestinal mucosa SIgA titers before and after oral immunizations

2.2 攻毒試驗評估重組芽孢交叉保護作用 重組芽孢保護性試驗是評估其抗沙門氏菌感染免疫活性的另一個重要指標，同時通過對雞白痢沙門氏菌CVCC533 與鼠傷寒沙門氏菌SL1344 的OmpC 進行PCR 擴增與測序，并結合NCBI 數據庫中核苷酸與蛋白質BLAST 工具分析，二者OmpC 同源性高達99 %。通過方法1.6 計算鼠傷寒沙門氏菌SL1344 LD50為2×108cfu/只(95 %置信區間為1.31×108cfu～3.0×108cfu)。本試驗選取2×LD50與10×LD50兩個劑量進行小鼠攻毒試驗，觀察72 h，結果顯示，通過灌胃和拌料飼喂給予重組芽孢的A 組和C 組小鼠均可完全保護2×LD50攻毒劑量的鼠傷寒沙門氏菌SL1344 感染，而對照組(B、D 與E 組)在24 h 內相繼死亡。在使用10×LD50劑量攻毒試驗中，對照組(B、D 與E 組)均在攻毒后16 h 內死亡，而重組芽孢組在72 h 的觀察期內保護率均為50 %(表3)。

表3 重組芽孢對鼠傷寒沙門氏菌SL1344攻毒交叉保護作用Table 3 Cross-protection of mice immunized with recombinant spores against the challenge with S.typhimurium strain SL1344

3 討論

通過口服等粘膜途徑免疫的粘膜疫苗可以刺激機體產生較高水平的局部免疫甚至系統性免疫反應，能夠有效阻止病原體、致敏源等有害物質通過粘膜表面侵入機體[13]。沙門氏菌作為常見的腸道致病菌，主要通過突破腸道上皮粘膜屏障侵入機體而引起急性或慢性感染[14]。因此，研制可有效刺激局部粘膜免疫反應的粘膜疫苗對預防沙門氏菌感染意義重大。

本實驗選取兼具極佳穩定性與安全性的枯草桿菌芽孢展示系統表達與遞送在臨床分離的多種沙門氏菌血清型中具有高度保守性的雞白痢沙門氏菌主要表面抗原OmpC，結果表明，與對照組相比，口服重組芽孢可以誘導產生極顯著(p<0.01)水平的血清IgG 與腸粘膜SIgA 特異性抗體。相對于使用莢膜多糖Vi 抗原等其他成份制備的亞單位疫苗不能刺激產生抗原特異性SIgA 抗體的缺點，表面展示OmpC 的重組芽孢經口服后可被M 細胞攝取并轉移至派伊爾氏淋巴集結中，在那里可與抗原遞呈細胞及免疫細胞相互作用激發粘膜免疫應答，產生抗原特異性SIgA 抗體，而這一特性對預防通過粘膜侵入機體的沙門氏菌至關重要[14-15]。

感染哺乳動物與鳥類的大多數沙門氏菌屬于腸道沙門氏菌，該類沙門氏菌不但血清型眾多，而且往往具有宿主特異性，缺乏交叉保護作用，因此限制了沙門氏菌疫苗的應用[1,3]。研究表明通過免疫沙門氏菌外膜蛋白等成份，可以刺激產生具有交叉保護作用的免疫反應[12]。在其中一項研究中，研究者使用孔蛋白免疫小鼠后，使用同源或異源沙門氏菌進行攻毒試驗，結果表明孔蛋白可提供顯著的交叉保護作用(p<0.01)[12]。雞白痢沙門氏菌OmpC 與鼠傷寒沙門氏菌OmpC 具有較高的同源性，在本實驗中重組芽孢所誘導的免疫反應對異源沙門氏菌感染具有一定交叉保護作用，為研發新型沙門氏菌疫苗提供了新的思路。

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