整合埃博拉病毒囊膜蛋白的偽病毒的構建

王玉杰，王 斌，時 靜，胡 丹，于 群，鄭永輝

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室-美國密歇根州立大學天然免疫聯合實驗室，黑龍江哈爾濱 150001)

埃博拉出血熱自1976 年在非洲扎伊爾首次爆發以來，已經在非洲引起多次暴發。其中以2014 年在非洲中部國家發生最為嚴重，共造成10 000 多人死亡，引起各國科學家的廣泛關注[1]。

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)屬于絲狀病毒科，其基因組為單股負鏈RNA，該病毒可以引起高度接觸性出血熱癥狀，致死率可達90 %，為病死率最高的傳染病病原之一[2-3]。EBOV 共分為5 個亞型，即扎伊爾型、蘇丹型、萊斯頓型、本迪步焦型和科特迪瓦型[4-5]。病毒的基因組編碼7 種蛋白，依次為NP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24 和L。其中GP 在翻譯后水解為GP1、GP2 兩種形式[6-8]。病毒通過其GP 與靶細胞表面的受體結合，而啟動感染過程[9]。目前對EBOV 病仍沒有有效的疫苗防制方法，由于該病毒的活毒操作需要在生物安全4 級實驗室進行，因此有必要建立一個能夠替代活病毒操作的、安全方便的病毒研究平臺。

偽病毒是人為構建的一種外表面由靶病毒的囊膜蛋白作為外殼，而內部骨架卻是由另一種病毒的核酸及蛋白組成的病毒顆粒[10-11]。這種病毒表面缺少自身囊膜蛋白，基因組上也沒有編碼囊膜蛋白的基因，因此只能進行單輪感染，屬于復制缺陷型病毒。由于表面包裹的是靶病毒的囊膜，因此可以模擬真病毒研究病毒的侵入機制，尤其適用于在常規條件下對高度危險性病原的研究。本研究通過將含有GP 基因的重組質粒與囊膜蛋白缺失、表達綠色熒光蛋白(GFP)的人免疫缺陷病病毒1 型(HIV-1)基因組的重組質粒共轉染293T 細胞，構建了具有一輪感染力的偽型EBOV，為后續研究EBOV 的感染機制及中和抗體的篩選提供了一個良好的平臺。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 表達GFP 蛋白及表面囊膜蛋白基因缺失的HIV-1 基因組的重組質粒pNL-△Env-GFP、293T、Vero、人宮頸癌細胞(Hela)、人骨肉瘤細胞(Ghost)細胞系均由本實驗室保存；與Flag 標簽融合表達的EBOV 囊膜蛋白GP 基因的重組質粒pcDNA-EboVGP 由密蘇里大學分子微生物與免疫學系Liu Shan-lu 教授饋贈；聚乙烯亞胺(PEI)購自Polysciences 公司；鼠源抗Flag 標簽抗體和兔源抗GP 的單克隆抗體(MAb)購自Sino Biological 公司；HRP 標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG(IgG-HRP)購自Jackson 公司；ECL 底物顯色液購自Thermo 公司；

1.2 EBOV GP蛋白的表達鑒定 將0.5×106個293T細胞鋪于6 孔板，37 ℃5 % CO2中培養24 h 后，將2 μg pcDNA-EboVGP 與6 μL PEI 轉染細胞，4 h更換含有10 %胎牛血清、1 %青霉素及1 %鏈霉素的培養液。以質粒pcDNA3.1 為空白對照，轉染后48 h 收集細胞，經PBS 洗滌，RIPA 冰浴裂解10 min。利用SDS-PAGE 檢測后，轉印NC 膜，分別以鼠源Flag 抗體和兔源Ebov-GP 抗體為一抗，分別以羊抗鼠和羊抗兔IgG-HRP 為二抗，ECL 孵育，膠片曝光，進行western blot 鑒定。

1.3 偽型EBOV的組裝及檢測 將3.5×106個293T細胞鋪于100 mm 的細胞培皿中，將10 μg pcDNAEboVGP、10 μg pNL-△Env-GFP 與30 μL PEI 按上述轉染方法進行共轉染。同時以轉染10 μg pNL-△Env-GFP 與20 μL PEI 為對照。48 h 后收集細胞培養上清，3 000 r/min 低速離心10 min 后25 000 r/min 超速離心2 h，棄上清，90 μL RIPA 重懸管底沉淀，按照上述方法進行western blot 檢測，并以HIV 基質蛋白(p24)及β-actin 蛋白作為檢測內參。

1.4 偽型EBOV的感染 采用制備的偽病毒粒子分別感染單層的Vero、293T、Ghost、Hela 細胞。于感染后48 h 通過熒光顯微鏡觀察報告基因GFP的表達，同時收集病毒感染后的細胞，流式細胞儀分析假病毒感染細胞的情況，計算GFP 陽性細胞比率(GFP 陽性細胞比例間接反映了偽型病毒粒子對細胞的感染水平)，以確定偽病毒在各種細胞中的感染力。

2 結果

2.1 EBOV GP蛋白表達的鑒定 將重組質粒pcDNA-EboVGP 和pcDNA3.1 空白對照質粒分別轉染293T 細胞后，48 h 后收集細胞進行蛋白裂解。Western blot 試驗顯示，利用鼠源Flag 標簽抗體及兔源抗EBOV GP 蛋白特異性抗體均能夠檢測到GP 蛋白的表達，而空白對照組未檢測到蛋白表達(圖1)。表明GP 蛋白可以正確的表達。

2.2 偽型EBOV的組裝 將重組質粒pcDNAEboVGP 和pNL-△Env-GFP 重組質粒共轉染293T 細胞，48 h 之后收集轉染細胞上清。Western blot 結果顯示，pNL-△Env-GFP 質粒轉染細胞以后，HIV 基質蛋白p24 能夠表達，表明病毒的基因組能夠提供偽型病毒包裝所需的相關組分。對超速離心純化的偽型病毒粒子進一步進行western blot 檢測，結果表明HIV p24 蛋白與GP 蛋白能夠同時被檢測到，而陰性對照組僅能夠檢測到p24 蛋白(圖2)，表明GP蛋白與HIV 基因組及相關蛋白進行了有效組裝。

圖1 EBOV GP 蛋白在293T 細胞中的表達Fig.1 The expression of the GP protein in the 293T cells

圖2 假病毒粒子組裝的檢測Fig.2 Detection of the package of GP-pseudotyped virus

2.3 偽型EBOV的感染試驗 收集轉染后含有偽病毒的上清液分別感染Ghost、Hela、Vero、293T細胞系，結果顯示感染48 h 后在幾種細胞系中均可檢測到報告基因GFP 的表達(圖3A)；為確定病毒對不同細胞的感染效率差異，收集感染后的細胞，通過流式細胞儀進行檢測，計算GFP 陽性細胞比率。結果表明，構建的偽病毒能夠感染6 種細胞，其中對Ghost、Vero 的感染效率較高，但對Hela、293T 細胞感染效率較低(圖3B)，表明Ghost、Vero兩種細胞更適合于偽型病毒的特性研究。

3 討論

圖3 假病毒對不同細胞的感染Fig.3 The infection of the pseudovirus in different cells

生物安全是公共安全領域優先發展領域中的重要內容之一，而EBOV 具有極強的接觸傳染性，必須在生物安全4 級實驗室完成對該病毒的實驗操作，為研究帶來了諸多不便。由于偽型病毒是復制缺陷型，只具有一輪感染力，因此為病毒的研究提供了一種安全、有效的技術手段。近來，偽型病毒的構建和應用為研究高致病性病毒的囊膜蛋白的結構和功能提供了良好的平臺。目前應用的假病毒核心主要是以HIV-1 為基礎的慢病毒和以VSV、MMLV 病毒為基礎的逆轉錄病毒[12]。本研究是通過構建表達EBOV 囊膜蛋白基因的重組質粒，與囊膜蛋白缺失、表達有綠色熒光GFP 蛋白的HIV-1 基因組的重組質粒共轉染293T 細胞，結果表明，兩種質粒所攜帶蛋白的基因均可以在293T 細胞中正確表達，并且表達后可以進行組裝獲得偽病毒粒子，以此模擬活病毒進行細胞的感染試驗，從而可以更加方便安全地研究EBOV 的病原學、致病機理及免疫學等相關工作，為攻克EBOV 準備理論基礎。

目前攜帶有熒光素酶或者GFP 報告基因的假病毒具有很廣泛的應用，如SARS-CoV[13]、H5N1 高致病性禽流感病毒、丙型肝炎病毒等均有過報道，本研究中利用帶有GFP 作為報告基因的HIV 慢病毒系統，獲得了具有感染力的EBOV GP 蛋白偽型病毒。GP 蛋白是誘導EBOV 中和抗體的關鍵蛋白，與病毒的入侵、細胞毒性等均起著關鍵作用，本研究構建的偽型病毒為病毒特異性中和抗體的篩選及蛋白功能的研究奠定了基礎。

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