抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的放線菌篩選及其活性研究

謝婷婷，陳 偉,2*

(1.塔里木大學生命科學學院新疆兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學動物科學學院新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是引起奶牛隱性乳房炎的重要條件致病菌之一。臨床研究顯示，表皮葡萄球菌的致病性逐年加強，原因可能是該病原菌極易形成生物膜(Biofilm，BF)，而BF往往能夠使病原菌有效地黏附定植在奶牛乳腺上皮細胞表面，損害宿主免疫細胞，這是奶牛乳房炎反復發作并且難以徹底治愈的主要原因[1]。

大多數放線菌能夠產生具有生物活性的化合物，是抗生素的主要來源。研究表明，一些放線菌能夠產生抑制細菌BF 形成的活性物質，如吲哚，蛋白酶類等，與傳統抗生素機制完全不同的是這些活性物質在不影響病原菌生長的前提下，通過干擾病原菌BF 形成相關基因表達來實現抑制作用[2-3]。臨床研究表明，病原微生物在抗生素選擇性壓力的存在下，會逐漸產生耐藥性[4]。與傳統的抗菌藥物相比，這類活性物質所表現出的“零”抗生素篩選壓力，在一定程度上能夠緩解細菌耐藥性問題。因此，細菌BF 形成抑制劑作為新一代抗生素，在抗BF 感染領域具有廣泛的應用前景。本研究通過篩選獲得具有抑制表皮葡萄球菌BF 形成活性的放線菌，為開發利用新疆放線菌資源以及尋找以抑制BF 形成為靶點的新型抗生素提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養基 表皮葡萄球菌ATCC35984(生物膜形成陽性菌株)由上海復旦大學醫學院饋贈；185 株新疆南疆地區土壤放線菌為本實驗室保藏的菌株。

放線菌活化和斜面保存培養基(淀粉20 g、KNO31.0 g、K2PO40.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂16.0 g，pH7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min 備用)、放線菌發酵培養基(小米15 g、蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、CaCO31 g，pH7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min 備用)、胰蛋白大豆肉湯培養基(Tryptic Soy Broth，TSB)，均由本實驗室配置備用。

1.2 放線菌菌株活化及發酵 將保藏的放線菌株菌液涂布于固體平板上，37 ℃培養4 d～5 d 進行活化，觀察菌落生長情況。將活化的菌接種于發酵培養基中，28 ℃，180 r/min 發酵7 d～9 d，同時觀察菌體生長情況。發酵液10 000 r/min 離心20 min，取上清，0.22 μm 無菌微孔濾膜過濾，去除菌體后，-20 ℃貯藏備用。

1.3 放線菌發酵液對表皮葡萄球菌BF形成的影響采用微量板半定量法[5]檢測放線菌發酵液對表皮葡萄球菌的影響，按1∶100 的接種比例將過夜培養的菌液接種至TSB 培養基中，振蕩搖勻。配制不同濃度梯度(50 %、40 %、30 %、20 %、10 %)的發酵液與菌液的混合液，取200 μL 混合液至96 孔細胞培養板中，每個濃度梯度接種4 孔。每一培養板中同時設空白對照(等體積的TSB 培養基和發酵液混合液)各4 孔。37 ℃靜置培養24 h 后測定OD590nm，無菌水洗去未黏附細菌。56 ℃烘干固定1 h，利用0.5%結晶紫染色5 min，沖洗后晾干，測定OD490nm。所有BF 形成檢測試驗均在不同時間重復3 次。

1.4 放線菌發酵液對表皮葡萄球菌BF不同形成階段的影響 參照文獻[6]操作，按照體積比1∶100 的比例接種生長至對數期的菌液至TSB 培養基中，混勻。吸取100 μL 稀釋菌液至96 孔板中，分別加入放線菌發酵液至終濃度為50%、40%、30 %、20 %、10 %，每個濃度梯度接種4 孔，每一培養板中同時設空白對照(等體積的TSB 培養基和對應濃度發酵液混合液)各4 孔。37 ℃靜置培養4 h 后，按照1.4所述測定OD590nm、OD490nm值，檢測初始黏附期BF形成。

按照上述操作將稀釋菌液加入至96 孔板中，37 ℃靜置培養4 h 后，重復以上步驟。37 ℃靜置繼續培養20 h，測定OD590nm和OD490nm值，檢測放線菌發酵液對表皮葡萄球菌聚集階段BF 形成的影響。

1.5 放線菌發酵液對表皮葡萄球菌BF結構的影響采用細胞爬片法[7]觀察表皮葡萄球菌BF 結構。按照體積比1∶100 的比例接種生長至對數期的菌液至TSB 培養基中，配制終濃度為50 %的發酵液與菌液的混合液。根據玻片的大小，先在每個培養皿里預備放置玻片的位置滴少量培養基，然后放置玻片，隨后加入含有放線菌發酵液的菌懸液，靜置培養24 h，取出爬片，無菌水沖洗2 遍，加入冷丙酮于-20 ℃固定10 min，室溫吹干。0.5 %結晶紫染色5 min，去離子水沖洗多余染料，40 倍光學顯微鏡下觀察BF 爬片結構。

2 結果

2.1 具有抑制BF形成活性的放線菌篩選 選取185 株新疆南疆地區土壤放線菌菌株，采用微量板半定量法篩選抑制表皮葡萄球菌BF 形成能力的菌株，結果顯示有96 株對表皮葡萄球菌BF 形成具有明顯的抑制作用，抑制率高達50 %以上的菌株有118 株，占檢測總菌株數的65.6 %(圖1)。其中放線菌TRM46200、41337、46814 對表皮葡萄球菌生長無明顯影響，但對其BF 形成具有明顯的抑制作用，終濃度為50 %的發酵液其BF 抑制率分別為86.9%、87.8%、94.3%(圖2)。

圖1 185 株放線菌抑制表皮葡萄球菌BF 形成能力檢測Fig.1 Histogram of biofilm modulation with 185 actinomycetes strains for biofilm formation of S.epidermidis ATCC35984

圖2 放線菌TRM46200、41337、46814 發酵液抑制表皮葡萄球菌BF 形成能力檢測Fig.2 Spent medium of TRM46200,41337,46814 reduces S.epidermidis ATCC35984 biofilm formation

2.2 放線菌對表皮葡萄球菌BF不同形成階段的影響 以放線菌TRM46200、41337、46814 作為供試菌株，檢測其發酵液對表皮葡萄球菌初始黏附期和聚集階段BF 形成的影響，結果顯示放線菌TRM46200、41337、46814 發酵液對表皮葡萄球菌BF 形成的影響主要在BF 形成初始黏附階段，對聚集階段影響不明顯(圖3)。

2.3 放線菌對表皮葡萄球菌BF結構影響 采用細胞爬片法觀察放線菌對表皮葡萄球菌BF 結構的影響，結果顯示分別加入終濃度為50 %的放線菌發酵液后，附著在固相載體(玻片)表面的菌體明顯減少，BF 結構松散，易被破壞，而對照組結構致密(圖4)。

3 討論

圖3 放線菌TRM46200、41337、46814 發酵液對表皮葡萄球菌ATCC35984 初始黏附(A)和聚集階段(B)BF 形成的影響Fig.3 Effect of TRM46200,41337,46814 spent medium on S.epidermidis ATCC35984 biofilm formation in attachment period(A)and aggregation period(B)

圖4 放線菌TRM46200、41337、46814 發酵液對表皮葡萄球菌BF 結構的影響Fig.4 Microscopic images of S.epidermidis ATCC35984 biofilms grown in the absence and presence of actinomycetes spent medium

本研究選取本實驗室從新疆南疆地區土壤分離鑒定的放線菌，篩選抑制表皮葡萄球菌BF 形成的活性菌株。BF 抑制活性篩選試驗結果顯示，新疆南疆地區土壤中分布的放線菌對表皮葡萄球菌具有較好的抗菌活性。3 株通過非抑菌途徑表現出抑制BF形成的放線菌分別是擬諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬和糖單孢菌屬。已有文獻報道，能夠產生無抗菌活性但可以有效抑制病原菌BF 形成的活性物質的放線菌主要是鏈霉菌屬的成員，如白色鏈霉菌(S.albus)[8]；秋吉鏈霉菌(S.akiyoshiensis)[9]；鏈霉菌屬BFI 230、250[3,10]。而本次實驗結果表明擬諾卡氏菌屬及糖單孢菌屬放線菌也可能是BF 抑制劑的重要來源。

細菌BF 形成機制十分復雜，外界及自身因素都會影響BF 的形成。任曉鏷等研究表明人為改變培養基營養物質、各種理化因素(NaCl、pH 等)及模擬的體內環境因素等，均能夠達到通過非抑菌途徑而抑制BF 形成的效果[11]。在病原菌BF 形成周期中，容易受到外界干擾的兩個時期是初始黏附期和聚集時期。通過研究放線菌TRM46200、41337、46814 發酵液對BF 形成周期的影響，發現上述3 株放線菌發酵液抑制表皮葡萄球菌BF 形成主要是通過影響其BF 形成的初始黏附期，一旦病原菌開始大量聚集，發酵液的抑制作用效果明顯減弱。黏附細菌在增殖同時，合成多種胞外多糖黏附素PIA 和聚集蛋白Aap 等，借助這些胞外多聚物，細菌之間相互黏附并聚集[12]。在依賴ica BF 形成過程中，胞間多糖黏附素PIA 是由ica 操縱子編碼的酶蛋白催化合成。表皮葡萄球菌ica 操縱子包含一個調節基因ica R，4 個功能基因(依次為ica A、ica D、ica B和ica C)[13]。ica R 調節4 個功能基因的轉錄，在BF形成過程中發揮不同的作用。任曉鏷在研究醉馬草對表皮葡萄球菌BF 形成的影響機制時發現，經過醉馬草水煎液處理的表皮葡萄球菌，ica B 基因的表達量和aap 基因的表達量明顯下調，ica R 基因的表達量明顯上調[14]。同時，研究發現外源加入低濃度Aap 蛋白，明顯抑制了初始黏附時期表皮葡萄球菌BF 的形成[15]。

本研究從新疆放線菌資源篩選表皮葡萄球菌BF形成抑制菌株，獲得3 株對表皮葡萄球菌無抑菌活性但能抑制其BF 形成的放線菌菌株，可從放線菌的發酵液中提取相關活性物質，用以表皮葡萄球菌BF 感染所致各種疾病(如奶牛乳房炎)的治療，從一定程度上可以減少耐藥菌株的產生，為從抗病原菌BF 感染的角度開發新型抗生素提供實驗依據。

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