北里乳桿菌97-1產細菌素97-1的抑菌活性及生物特性的研究

張 旺，劉琳琳，王云峰，王宏磊，祁小樂，高玉龍，王永強，高宏雷，李 凱，劉長軍，張艷萍，盧彤巖，何高明，王笑梅*，崔紅玉*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832002；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/禽免疫抑制病創新團隊，黑龍江哈爾濱 150001；3.哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司，黑龍江哈爾濱 150028；4.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江哈爾濱 150070)

細菌素(Bacteriocin)是由某些類細菌在代謝過程中產生的具有抑制其它細菌生長活性的蛋白質或多肽[1-2]。其中以乳酸乳桿菌(L.lacticacid)和乳酸短桿菌(L.breris)研究最為廣泛。1984 年，Anand 等首次在雙歧乳桿菌NCDC 1452 中發現Bifidocin B 能夠抑制革蘭氏陽性菌[3]。此后，Yildirim 等發現能夠產細菌素Cremoris R 的乳酸短桿菌[3-4]；Ghanbari 等在鱘魚體內分離得到產細菌素的乳酸乳桿菌[5-7]；Todorov等在發酵乳中分離得到產細菌素Bacteriocin AMA-K的植物乳酸乳桿菌AMA-K[8]。乳酸乳桿菌因來源不同，種屬不同，其所產的細菌素抗菌效果也有很大差異[9]，乳酸菌的抗菌活性主要包括其代謝過程中所產的細菌素，有機酸和過氧化氫[10]。乳酸菌所分泌的抗菌物質，能夠作為天然食品防腐劑來抑制病原菌及腐敗菌，或者作為“替代抗生素”應用于飼料添加劑等領域。

本實驗對北里乳桿菌97-1(Lactobacillus kitasatonis 97-1)分泌的細菌素97-1(Bacteriocin 97-1)的抑菌特性及理化特性進行初步研究，為進一步研制和開發微生態制劑提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株 北里乳桿菌97-1(簡稱：乳桿菌97-1)由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家重點實驗室從黑龍江省健康雞群腸道內容物中分離鑒定，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(微生物保藏號為CGMCC No.9440)和中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所菌種保藏中心；指示菌種單核細胞增生李斯特菌購自中國藥品生物制品檢定所；沙門氏菌CVCC578 及金黃色葡萄球菌CVCC0804 購自中國獸醫微生物菌種保藏中心；大腸桿菌ATCC25922 和鏈球菌ATCC69615 由河北北方學院動物科技學院惠贈，其他菌種詳見表3。

1.2 主要試劑 MRS 培養基購自青島海博公司，過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶均購自Sigma 公司，蛋白透析袋購自Millpore 公司。

1.3 細菌素的制備及鑒定 將乳桿菌97-1 在MRS培養液37 ℃靜置培養48 h 后離心分離保留上清液，以單核細胞增生李斯特菌為指示菌株，采用牛津杯法[7-9]進行抑菌實驗，通過平板菌落計數法進行指示菌的菌落計數，調整指示菌濃度為1×106cfu/mL。參照參考文獻[8-9]方法，將周圍6 個孔加入200 μL上清液，中間孔加入200 μL 的MRS 液體培養基(pH4.5)作為空白對照，37℃靜置培養24 h～72 h 測量抑菌圈直徑。同時，分別用過氧化氫酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶在各自作用的最適pH值下處理上清液，使各酶的終濃度為5 mg/mL，37 ℃處理2 h 后，再將pH 值調回6.5，用PBS 緩沖液將體積補至同一體積，以不加酶處理的上清液作為對照，以指示菌的抑菌活性作為鑒定細菌素的存在。

1.4 細菌素97-1的純化及物理、化學特性試驗

1.4.1 細菌素97-1 的純化 將乳桿菌97-1 在MRS培養液中37 ℃靜置培養48 h 后，置于80 ℃水浴30 min，滅活蛋白水解酶。分別用5 M 磷酸和5 M氫氧化鈉調節pH 值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 及11.0；4 ℃攪拌過夜。14 000 g/min，4 ℃，離心20 min，棄上清。用0.05 M的磷酸鈉(pH6.5)洗滌菌體，14 000 g/min，4 ℃，離心20 min，重復兩次，棄上清。用0.1 M 氯化鈉(pH1.5～2.0)重懸菌體，4 ℃攪拌過夜，使吸附在菌體表面的細菌素脫落，14 000 g/min，4 ℃，離心20 min，收集上清，透析除水，得到初步純化的細菌素，命名為細菌素97-1(Bacteriocin97-1)。

1.4.2 細菌素97-1 的高溫耐受試驗 取初步純化的細菌素97-1 分別置于30 ℃、37 ℃、42 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴中處理2 h 和121 ℃高壓15 min，以單增李斯特氏菌為指示菌進行抑菌活性檢測。

1.4.3 細菌素97-1 的酸堿耐受試驗 將初步純化的細菌素97-1 用5 M 磷酸和5 M 氫氧化鈉調節pH 值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，處理2 h 后調回pH6.0，以MRS 培養基(pH6.0)為空白對照檢測酸堿對細菌素97-1 的影響。

1.5 乳桿菌97-1的生長與產細菌素變化曲線的測定 將乳桿菌97-1 劃線，挑取單菌落進行復蘇，按1∶50 轉接到MRS 培養基中，37 ℃靜置培養，每2 h取樣一次，直至24 h，分別檢測菌液的OD600nm值及pH 值，繪制菌株生長曲線和pH 值變化曲線，同時以指示菌檢測上清液中細菌素的抗菌活性，以獲取細菌素產量隨菌株生長的變化關系。

1.6 細菌素97-1的抗菌譜范圍測定 以20 種常見革蘭氏陽性細菌和8 種革蘭氏陰性細菌(表3)作為測試菌進行抑菌活性測定。

2 結果

2.1 北里乳桿菌97-1產生細菌素的鑒定 采用牛津杯法進行乳桿菌97-1 的抑菌試驗，結果顯示菌株發酵上清液在6 個周圍實驗孔均產生了大約15 mm的抑菌圈(6 個重復)，而中央對照孔無抑菌圈產生，表明乳桿菌97-1 可以產生抗菌活性物質(圖1)。而乳桿菌97-1 的上清液經胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶處理后抑菌活力完全消失，表明發酵上清液的抗菌物質可以被蛋白酶分解，抗菌活性物質為蛋白類抗菌肽；但經過氧化氫酶處理的樣品仍具有抑菌活力，與未作任何處理的樣品抑菌活力一致，進一步表明發酵上清液中發揮抑菌作用的物質為蛋白類的細菌素而非過氧化氫(表1)。以上結果表明，乳桿菌97-1 所分泌的細菌素97-1 為蛋白類抗菌肽。

圖1 北里乳桿菌97-1 對單增李斯特氏菌的抑菌活性Fig.1 The antimicrobial activity of the bacteriocin against L.monocytogenes produced by L.kitasatonis 97-1

表1 乳桿菌97-1 上清中抑菌物質對各種酶的耐受性Table 1 The sensitive of bacteriocin produced by L.kitasatonis 97-1 to enzymes

2.2 細菌素97-1對高溫和強酸強堿的耐受性 將乳桿菌97-1 MRS 培養上清液進行高溫和強酸強堿處理，結果顯示該菌所產細菌素在121 ℃高壓處理15 min 后仍有90 %的抑菌活性(表2)，表明該細菌素具有高度的熱穩定性；而過酸處理(pH<2)和過堿(pH>10)處理后抗菌活性只有原來的30 %(過酸)和20 %(過堿)，其在pH4.0～8.0 范圍內具有穩定活性，抗菌活性維持在70 %～100 %。

表2 熱處理和酸堿處理對抗菌活性的影響Table 2 Effect of heat and pH on the antimicrobial activity

2.3 乳桿菌97-1的生長曲線與產細菌素變化曲線隨著乳桿菌97-1 在MRS 培養基生長，培養液pH 值從6.5 逐步下降至4.0。細菌素97-1 的產量隨著乳桿菌97-1 的生長而增加，在發酵14 h 后達到最大抑菌活性6 400(AU/mL)，并且抑菌活性在穩定期(6 h左右)內保持穩定(圖2)。

圖2 乳酸菌97-1 生長曲線及生長過程中抑菌活性和pH 值變化的相關性Fig.2 The growth curve of 97-1 and antimicrobial activity in the process of growth and the correlation of pH values

2.4 細菌素97-1的廣譜抗菌活性 以20 種常見革蘭氏陽性細菌和8 種革蘭氏陰性細菌作為測試菌進行抑菌活性測定，結果表明細菌素97-1 具有較廣的抑菌圖譜(表3)。

3 討論

本研究結果顯示北里乳桿菌所產生的細菌素97-1 具有廣譜抗菌活性，該結果與Yildirim 等在1998 年發現的細菌素Bifidocin 有所不同，細菌素Bifidocin 不能抑制金黃色葡萄球菌，產氣莢膜梭菌，鏈球菌等革蘭氏陽性菌和所有革蘭氏陰性菌[3]，只能抑制部分特定病原細菌。北里乳桿菌所產生的細菌素97-1 和Anand 等在1984 年發現的雙歧乳桿菌NCDC 1 所產生的Bifidocin B 抑菌范圍比較相近，具有同時抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的特性[4]，均具有廣譜抗菌活性。之前國內外發現的由革蘭氏陽性菌所產生的細菌素絕大部分是不能抑制革蘭氏陰性菌的生長，這種具有同時抑制革蘭氏陽性和陰性菌的細菌素只在雙歧桿菌屬的一些菌株中被發現，如乳桿菌NK24 所產的細菌素NK24。雙歧桿菌所產的細菌素目前已經在食品領域作為天然食品防腐劑得到應用，并具有很好的安全性。本研究發現的北里乳桿菌所產生的細菌素97-1 具有光譜抗菌特性，在生物技術領域具有廣泛應用前景和潛力。

表3 細菌素97-1 的抑菌圖譜Table 3 Bacteriostatic spectrum of bacteriocin 97-1

此外，細菌素97-1 具有良好的穩定性，一是具有高耐熱穩定性，能夠在121 ℃高壓下保持抑菌活性，這將為批量化生產和操作應用提供了條件；二是具有耐酸堿特性，在pH4.0～8.0 范圍內保持良好的抑菌活性，雖然部分限制其使用條件，但也為使用pH 來調控細菌素濃度成為可能。

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