雞毒支原體SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立

孫俊穎，劉志成，孫敏華，李冰玲，沈海燕，張春紅，董嘉文，李林林，張建峰*

(1.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東廣州 510640；2.廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640；3.廣東省獸醫公共衛生公共實驗室，廣東廣州 510640；4.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026)

雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)是柔膜體綱，支原體目，支原體科的一類無細胞壁，能夠自我復制的單細胞原核生物?；蚪M為雙鏈環狀DNA，僅0.9～1.2×106bp，G+C 含量低。MG 感染引起的禽慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease，CRD)廣泛分布所有養禽國家，在我國部分地區感染率高達75 %以上。該病可以通過水平和垂直方式傳播，并可以引起繼發感染，嚴重阻礙養禽業的健康發展?？刂芃G 感染的最根本有效方法是對感染雞群進行凈化，從根本上防止MG 的傳播和流行。但由于經濟原因，大多數雞場仍采用疫苗防控[1]。因此，建立一種敏感性高、特異性強、快速有效的檢測方法對雞群的早期診斷和凈化，以及對疫苗質量的監控和分子流行病學調查都具有重要意義。

目前MG 的檢測常采用血清學方法，如ELISA、血清平板凝集(SPA)、血凝抑制試驗(HI)作為雞群篩查方法[2]，采用病原分離培養和PCR 方法作為確證方法[3]?，F有檢測方法各有優點，但存在靈敏度低，存在交叉反應，培養周期長或樣品易污染等方面不足。熒光定量PCR 方法采用熒光信號，極大提高檢測的靈敏性，同時可以定量檢測，并且能夠避免常規PCR 電泳檢測所帶來的高污染率，成為病原檢測的重要技術。本研究以MG 16S rDNA 基因為靶標，建立了MG 的熒光定量PCR 檢測方法，顯著提高了MG 檢測的敏感性和特異性，為病原早期診斷和疫苗定量監測提供了有效手段。

1 材料和方法

1.1 菌株、病毒及臨床樣品 MG S6 株由中國農業大學獸醫藥理實驗室惠贈；MG Ts-11 疫苗購自澳大利亞生物制品有限公司；MG 6/85 疫苗購自美國英特威公司；MG F36 疫苗購自廣東永順生物制藥公司；雞滑液支原體(M.synoviae，MS)、豬肺炎支原體(M.pneumonia of swine，MPs)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ALTV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)及雞新城疫病毒(NDV)均由本實驗室分離和保存；臨床樣品來源廣東粵西地區4 市(湛江、茂名、陽江、云浮)雞場疑似病料。

1.2 主要試劑 核酸抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和質粒抽提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T 載體和SYBR Premix Ex Taq 均購自TaKaRa 公司。

1.3 引物設計與合成 對GenBank 中登錄的不同國家和地區MG 16S rDNA 基因的序列進行比對，根據其保守區域設計一對特異性引物：5'-AGCTAA TCTGTAAAGTTGGTC-3'/5'-CGCTTCCTTGCGGTTA GCAAC-3'，預期擴增片段大小為186 bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 熒光定量PCR重組質粒標準品的制備 按照DNA 提取試劑盒說明提取MG S6 株DNA，以其為模板利用引物F/R 進行PCR 擴增，擴增產物經膠回收純化后，克隆于pMD18-T 載體中構建重組質粒，測定其濃度并計算拷貝數[4]后作為熒光定量PCR 的標準標準品。

1.5 反應條件的優化及標準曲線的建立 應用矩陣法對熒光定量PCR 的引物濃度(0.1 μM、0.3 μM、0.5 μM、0.7 μM)、退火溫度(51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃)等進行優化，以得到最佳反應條件。

將重組質粒標準品10 倍梯度稀釋至濃度范圍為1.96×108拷貝/μL～1.96×102拷貝/μL。以各濃度梯度的質粒DNA 為模板，采用建立的熒光定量PCR進行擴增，繪制動力學曲線，并通過儀器軟件自動生成標準曲線。

1.6 特異性試驗 以MG S6、MG Ts-11、MS、MPs、ALTV、NDV、AIV、IBV 的DNA 為模板進行熒光定量PCR 反應，以驗證該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 將重組質粒標準品10 倍梯度稀釋至1.96×101拷貝/μL，以每個稀釋度的標準品為模板，進行熒光定量PCR 擴增，以確定最低檢測限。判定標準為Ct 值在35 個循環以內的判定為陽性擴增，Ct 值高于35 個循環的判定為陰性擴增，同時進行普通PCR 擴增作為對照，比較兩者敏感性。

1.8 重復性試驗 選取1.96×106拷貝/μL、1.96×104拷貝/μL、1.96×102拷貝/μL 3 個稀釋度標準品作為模板進行批內和批間重復性試驗。每個稀釋度重復檢測3 次。根據循環閾值的差異計算批內和批間變異系數。

1.9 臨床樣本和疫苗檢測 采集30 份來自廣東不同地區的疑似雞慢性呼吸道病病料樣本，提取核酸，分別進行熒光定量PCR、常規PCR 和SPA 檢測，以比較3 種方法的靈敏度。將活疫苗用PBS 溶液溶解，取1 頭份量稀釋100 倍后，提取DNA，進行熒光定量PCR 試驗，檢測疫苗中病毒的含量。并對檢測為陽性的樣品進行測序驗證。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的制備 重組質粒經PCR 鑒定和測序顯示，PCR 產物約為186 bp，表明16S rDNA 片段已克隆至pMD18-T 載體中。重組質粒標準品濃度為62 ng/μL，根據公式計算分子拷貝數為1.96×1010拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR反應條件的優化 優化熒光定量PCR 反應體系為10 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 5 μL，上下游引物(10 μM)各0.3 μL，模板1 μL，補加雙蒸水至10 μL。優化熒光定量PCR 反應參數：95 ℃30 s；95 ℃5 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，在72 ℃采集熒光，共進行40 個循環；HRM 65 ℃～90 ℃。

2.3 熒光定量PCR標準曲線的建立 將重組質粒標準品10 倍倍比稀釋后作為模板，采用優化的熒光定量PCR 條件進行擴增，以重組質?？截悢档某Ｓ脤抵?lg copies)為x 軸，Ct 值為y 軸，得到標準曲線圖(圖1)，標準曲線方程為y=-3.24x+35.47，相關系數R2=0.999，結果呈良好線性關系。熔解曲線分析表明，其熔解溫度為85 ℃～86 ℃，擴增的目的片段僅產生特異性單峰，無引物二聚體和非特異性擴增。

2.4 特異性試驗 采用建立的熒光定量PCR 方法檢測MG S6、MG Ts-11、MS、MPs、NDV、ILTV、AIV、IBV，結果顯示僅MG 出現擴增曲線，其余均無閾值信號產生，表明建立方法特異性良好(圖2)。

2.5 敏感性試驗 對1.96×1010拷貝/μL～1.96×101拷貝/μL 10 個濃度的重組質粒標準品進行敏感性試驗，結果顯示，建立的熒光定量PCR 方法對重組質粒標準品的檢測下限為1.96×101拷貝/μL，而常規PCR 的檢測下限為1.96×103拷貝/μL(圖3)，表明熒光定量PCR 比常規PCR 的敏感性高100 倍。

圖1 熒光定量PCR 標準曲線和熔解曲線Fig.1 Standard curve and melting curve of SYBR Green I real-time PCR for detection of recombinant plasmids with series dilutions

圖2 MG 熒光定量PCR 的特異性擴增曲線Fig.2 The specific amplification curve of SYBR Green I real-time PCR for detection of MG

圖3 MG 熒光定量PCR 和常規PCR 敏感性試驗比較Fig.3 Sensitivity test comparision of SYBR I Green real-time PCR and conventional PCR for MG

2.6 重復性試驗 采用建立的熒光定量PCR 方法對1.96×106拷貝/μL、1.96×104拷貝/μL、1.96×102拷貝/μL 的標準品做3 次重復檢測，批間和批內的變異系數均小于2 %(表1)，表明該方法具有良好的重復性。

表1 熒光定量PCR 重復性試驗結果Table 1 The reproducibility test of the SYBR I Green real-time PCR

2.7 臨床樣品的檢測 抽檢來自粵西4 市雞場呼吸道病的肺臟樣品30 份，利用建立的熒光定量PCR、常規PCR 及SPA 方法對病料樣品進行檢測。結果顯示，在30 份待檢樣品中，熒光定量PCR 檢出12份陽性，常規PCR 檢出10 份陽性，SPA 檢出7 份陽性(表2)。表明本實驗建立的熒光定量PCR 的敏感性顯著高于常規PCR 及血清學方法。采用熒光定量PCR 方法對活疫苗檢測的結果每頭份為2.0×107拷貝/μL。

表2 臨床樣品檢測結果Table 2 Detection results of clinical samples

3 討論

目前MG 的檢測方法主要有血清學方法、分離培養法、分子生物學方法等。血清學方法，如ELISA 及膠體金技術、SPA、HI 等臨床常用的檢測方法[5-7]，廣泛應用于養禽場篩選試驗，但很難檢測出早期的MG 感染，并且敏感性低。病原分離培養仍是病原檢測的金標準，但MG 病原生長條件苛刻，培養周期長(7 d～10 d)，給分離培養帶來嚴重挑戰，而且MG 常伴發有混合感染，也增加了MG分離的難度，不適用于早期診斷。PCR 方法敏感性高，特異性強，是目前MG 最常采用的分子生物學檢測方法，一些學者建立了以mgc2、16S rRNA、LP、gapA 基因為靶標的PCR 檢測方法[8-11]。近年來開始利用熒光定量PCR 技術檢測MG。Kahya 和周云蕾等分別以mgc 基因和PvpA 基因為靶基因序列建立了熒光定量PCR 方法，檢測限分別為0.9 pg/μL和72 拷貝/反應[7-12]；Fraga 建立了能夠同時區分MG 和MS 的Taq man 熒光定量PCR 方法，對MG的檢測限為25 拷貝/反應，定量限為102拷貝/反應[13]；本研究以16S rDNA 為靶標建立了SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法，檢測限為19.6 拷貝/μL(19.6 拷貝/反應)。

在疫苗的質量監控中，病毒含量是至關重要的，建立簡便、快速、可靠的病原檢測方法對疫苗生產的監控具有實際意義。目前主要是通過活菌計數方法來檢測MG 疫苗中的病原含量，但活菌計數方法操作繁瑣，所需時間長，不能達到實時監控，誤差也較大。本實驗采用熒光定量PCR 對F36 株弱毒疫苗的病毒含量進行了測定，結果測得每頭份MG 的含量為2.0×107拷貝/μL。該方法的建立為弱毒疫苗的質量監控提供了一種新的快速檢測方法。

綜上所述，本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 方法特異性高，重復性好，靈敏度比常規PCR 高100 倍，并且可避免常規PCR 電泳檢測所帶來的高污染率，在敏感性和檢測速度上有明顯提高，并且可精確定量，可應用于MG 感染引起的慢性呼吸道病的早期檢測及疫苗監測等方面的定量研究。

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