IMP3蛋白及Ki-67在腦膠質瘤中的表達及臨床意義*

張 冉 王全義 張軍臣 于珊珊 王海濤 敖啟林

(1濟寧醫學院附屬醫院，山東 濟寧 272029；2濟寧市第二人民醫院，濟寧 272049)

·臨床醫學·

IMP3蛋白及Ki-67在腦膠質瘤中的表達及臨床意義*

張 冉1王全義1張軍臣1于珊珊2王海濤1敖啟林1

(1濟寧醫學院附屬醫院，山東 濟寧 272029；2濟寧市第二人民醫院，濟寧 272049)

目的 探討胰島素樣生長因子IImRNA結合蛋白3(IMP3蛋白)及Ki-67在腦膠質瘤中的表達以及臨床意義。方法 選取我院2008年1月至2012年10月手術切除的不同級別的膠質瘤60例(Ⅰ級5例，Ⅱ級20例，Ⅲ級20例，Ⅳ級15例)及5例正常腦組織，應用免疫組化Envision二步法檢測IMP3蛋白及Ki-67在不同級別膠質瘤中的表達，分析二者與膠質瘤惡性程度的關系以及二者的相關性。結果 IMP3 在膠質瘤各級別的表達中有統計學意義(χ2=41.17，P<0.05),其中膠質瘤Ⅲ～Ⅳ級陽性表達率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ級(91.4% vs 8%，χ2=41.34，P<0.05)。膠質瘤標本的Ki-67指數(Ki-67 LI)范圍為0% ～ 50%， 在膠質瘤各級別的表達中有統計學意義(χ2=29.80，P<0.05),其中膠質瘤Ⅲ～Ⅳ級陽性表達率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ級(91.4% vs 20%，χ2=50.29，P<0.05)。IMP3 蛋白的陽性表達率與 Ki-67 蛋白的陽性表達率有正相關性(r=0.774，P<0.05)。結論 IMP3及Ki-67在腦膠質瘤中的表達均與膠質瘤的惡性程度呈正相關，二者聯合應用可作為評價膠質瘤級別的重要參考指標。

胰島素樣生長因子IImRNA結合蛋白3；細胞增殖核抗原Ki-67；膠質瘤

膠質瘤是顱內常見的惡性腫瘤，由于血腦屏障的特殊結構，一般化療藥物的療效不顯著。因此，腦膠質瘤治愈率差，復發率、致殘率以及死亡率高，是全身惡性腫瘤中預后最差者之一。胰島素樣生長因子IImRNA結合蛋白3(insulin-like growth factor II mRNA-binding protein 3，IMP3)是癌胚RNA結合蛋白，它在胚胎形成時調節胰島素樣生長因子II(IGF-II)的轉錄,在許多正常組織中的表達非常低。一些腫瘤被發現表達IMP3蛋白，包括肺癌、直腸癌、胰腺癌[1-3]以及發生于他組織的腫瘤。細胞增殖核抗原Ki-67(nuclear-associated antigen Ki-67)是評價腫瘤增殖程度的較好指標。它廣泛表達于增殖期細胞，而靜止期細胞則不表達[4]。Ki-67表達水平反映了細胞增殖情況，是目前腫瘤增殖活動研究中較為精確、可靠的增殖期標志物。

雖然IMP3是近年來基礎與臨床的研究熱點，但目前在中樞神經系統腫瘤中關于IMP3的表達研究不多，本課題研究IMP3和Ki-67在各級別腦膠質瘤中的表達以及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究資料

選取2008年1月至2012 年10月濟寧醫學院附屬醫院神經外科手術切除的腦膠質瘤組織標本60例及正常腦組織5例。其中男47例，女18例；平均年齡(47.4±9.5)歲。 所有切片均經兩名病理專業高級職稱醫師共同診斷，并參考免疫組織化學如GFAP、Olig-2、CD34、EMA、Ki-67等結果，以世界衛生組織WHO(2000)神經系統腫瘤分類標準(核異型性、核分裂象、血管增生和/或壞死)，將膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ級。在60例膠質瘤組織標本中，Ⅰ級5例、Ⅱ級20例、Ⅲ級20例、Ⅳ級15例；其中節細胞膠質瘤3例，毛細胞星型細胞瘤2例，彌漫型星型細胞瘤21例，少突膠質細胞瘤15例，間變型室管膜細胞瘤4例，膠質母細胞瘤 15 例。

1.2 儀器設備

石蠟切片機 LEICA-RM2245(德國)；YF-TFB型生物組織攤烤片機(湖北孝感亞光醫療電子有限公司)；KB-TK-72精密烤箱(東莞科寶)；家用微波爐( 美的)；冰箱BCD-206TS(青島Hair)；隔水式電熱恒溫箱(上海)；微量移液器(上海大邁儀器有限公司)；光學照相顯微鏡(LEICA-DM2500德國)；WMY-01數顯溫控儀 (上海)；101-A 型數顯電熱鼓風干燥箱(北京永光明醫療儀器廠)；高清晰度彩色病理圖片分析系統(西安華海HMIAS)。

1.3 試劑

鼠抗人IMP3單克隆抗體(英國 DAKO公司)；免疫組化試劑盒(SP)(北京中杉生物技術有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京金橋生物技術有限公司)；APES 北京中杉金橋生物技術有限公司；緩沖液 (0.05M PBS pH 7.4 緩沖液，0.05M pH 6.0檸檬酸緩沖液)、梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)、二甲苯、松節油、甘油、丙酮、過氧化氫、碳酸氫二鈉、蘇木精、伊紅染液等。

1.4 實驗方法

1)石蠟切片，厚4μm，將石蠟組織片貼附于防脫多聚賴氨酸載玻片上，置于60℃烤箱中烤片1h，取出備用。2)石蠟切片脫蠟。3)將切片置于3%過氧化氫中，10min后取出，以阻斷內源性過氧化物酶PBS沖洗3次，每次5min。4)對組織抗原進行修復，取一定量EDTA緩沖液(pH=9.0)于抗原修復盒中，將組織切片置于塑料切片架上，微波爐中火修復10min，取出，冷卻至室溫。之后用PBS洗3次，每次5min。5)甩去切片PBS液，每張切片加50μl IMP-3(1∶50稀釋)，37℃下靜置1h。6)用PBS液沖洗3次，每次5min。7)甩去切片PBS液，每張切片加Envision DAB-A 50μl 37℃烤箱中靜置30min或者室溫下靜置1h。8)PBS液沖洗3次，每次5min。9)甩去切片PBS液，每張切片加100μl DAB顯色劑工作液(DAB-B液與DAB-C液比例為50∶1，避光，用前30min配制)。鏡下觀察3～10min，陽性顯色為棕黃色顆粒。10)用蒸餾水沖洗10min，蘇木素復染2min，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗10～15min。11)脫水，透明，封片，鏡檢。

1.5 結果判定

IMP3陽性細胞百分比評分：陰性(-),未見著色細胞；弱陽性(+)，著色細胞數<25%；中度陽性()，著色細胞數占 25%～ 50%；強陽性()，著色細胞數 > 50 %。

Ki-67蛋白一般采用 Ki-67 指數(Ki-67LI)表示細胞的增殖程度，高倍鏡 (×400)下每個視野數 200 個瘤細胞，計算其陽性細胞所占百分比。陰性(-)，著色細胞<5%；弱陽性(+)，著色細胞數5%～10%；中度陽性(),著色細胞數占 11% ～ 25%；強陽性(),著色細胞數>25%。

1.6 統計學方法

所有數據采用 SPSS13.0處理,應用χ2檢驗分析IMP3和Ki67在各級別膠質瘤中的表達，應用 Spearman 等級相關性分析進行IMP3和Ki67的相關分析，P<0.05為差異顯著，具有統計學意義。

2 結果

2.1 IMP3在各級別腦膠質瘤中的表達

IMP3蛋白主要表達于細胞質內，以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性，在正常腦組織中無表達，在膠質細胞瘤Ⅰ級未見有表達(見圖1)，但隨著膠質瘤級別的升高，IMP3表達強度也隨著增加(見圖2～圖4)。

圖1 IMP3在WHO I級膠質瘤中的陰性表達(×100)

圖2 IMP3在WHO II級膠質瘤中的弱陽性表達(×200)

圖3 IMP3在WHO III級膠質瘤中的中陽性表達(×200)

圖4 IMP3在WHO IV級膠質瘤中的強陽性表達(×100)

免疫組化實驗結果顯示：在膠質細胞瘤I級陽性表達率為0%，膠質細胞瘤II級陽性表達率為10%(弱陽2例、中陽0例、強陽0例)，膠質細胞瘤III級陽性表達率為90%(弱陽6例、中陽10例、強陽2例)，膠質細胞瘤IV級陽性表達率為93.3%(弱陽0例，中陽1例，強陽13例)。IMP3 在膠質瘤各級別的表達中有統計學意義(χ2=41.17，P<0.05),其中膠質瘤III～IV 級陽性表達率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ 級(91.4% vs 8%，χ2=41.34，P<0.05)差異有統計學意義。見表1。

表1 IMP3在不同級別膠質瘤中的表達

2．2 Ki-67在各級別腦膠質瘤中的表達

Ki-67表達于細胞核內，以核內出現棕色或棕黃色染色為陽性。正常腦組織中未見陽性表達，膠質瘤細胞的Ki-67染色范圍為0%～50%，Ⅰ級膠質瘤為陰性表達(見圖5)，但隨著膠質瘤級別的升高，Ki-67表達強度也逐漸增強(圖6～8)

圖5 Ki-67在WHO I級膠質瘤中的陰性表達(×100)

圖6 Ki-67在WHO II級膠質瘤中的弱陽性表達(×200)

圖7 Ki-67在WHO III級膠質瘤中的中陽性表達(×100)

圖8 Ki-67在WHO IV級膠質瘤中的強陽性表達(×200)

免疫組化實驗結果顯示：Ⅰ級膠質瘤的陽性表達率為0%、Ⅱ級膠質瘤的陽性表達率為25%(弱陽性4例，中陽性1例，強陽性0例)、Ⅲ級膠質瘤陽性表達率為90%(弱陽性17例，中陽性1例，強陽性0例)、Ⅳ級神經膠質瘤陽性表達率為93.3%(弱陽性5例，中陽性7例，強陽性2例)。Ki67 在膠質瘤各級別的表達中有統計學意義(χ2=29.80，P<0.05),其中膠質瘤Ⅲ～Ⅳ級陽性表達率明顯高于 Ⅰ～Ⅱ 級(91.4% vs 20%，χ2=50.29，P<0.05)，差異有統計學意義。見表2。

表2 Ki-67在不同級別膠質瘤中的表達

2．3 腦膠質瘤中IMP3和Ki-67表達的關系

在 60 例腦膠質瘤中，IMP3 蛋白的陽性表達與 Ki-67 蛋白的陽性表達采用 Spearman 等級相關性分析(r=0.774，P<0.05)。二者呈正相關。見表3。

表3 IMP3和Ki-67的表達關系

3 討論

高級別的惡性程度較高的腦膠質瘤起源于腦部神經膠質細胞，是最常見的顱內惡性腫瘤，腦膠質瘤呈侵襲性生長，總體療效不佳，尤其是惡性程度較高的膠質瘤，具有高度間變的生長特點，術后復發快，預后差，嚴重威脅人類的健康。而腫瘤細胞的惡性程度則和其增殖能力，以及誘導產生蛋白酶降解細胞外基質、基底膜的能力有關。

IMP3在胚胎形成時調節胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的轉錄，進而調節IGF-Ⅱ的表達，而在肝癌和癌旁肝組織中均有IGF-Ⅱ的異常表達[5-7],IGF-Ⅱ基因高表達可能不僅與IGFn基因的異常表達有關，也與IMP3異常調控有關。IMP3促進IGF-Ⅱ mRNA的翻譯，進而增加IGF-Ⅱ水平。而IGF-Ⅱ和細胞表面的受體(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ受體)結合，產生胞漿內循環短路，放大了細胞持續生長信號的傳遞，加速了腫瘤細胞的增殖，維持其惡性表型[7-8]。

Findeis-Hosey等研究報道小鼠IMPS家族基因缺失可使CD44mRNA的下調，CD44是一種細胞黏附分子，能促使Ⅳ型膠原蛋白的降解并與細胞骨架蛋白相結合，CD44的下調可降低細胞與基質之間的黏附，促進細胞的轉移[9]。IMP3還可間接調節基質金屬蛋白1的表達，IMPS家族基因缺失可使基質金屬蛋白1降低對細胞外基質的浸潤，而細胞外基質的降解又是腫瘤侵襲、轉移及血管形成的重要因素；因此認為IMP3還能夠間接通過CD44和基質金屬蛋白酶等途徑參與了腫瘤惡性生物行為[10]。

Ki-67是一種核抗原蛋白，其在增殖細胞核中特異性表達， 它半衰期較短，其陽性表達覆蓋整個有絲分裂期，受背景干擾較小，能夠反映腫瘤的惡性程度及患者的預后[11]。被眾多數學者認為是反映腫瘤細胞增殖活性的一個重要指標[12]。

本文結果顯示，IMP3蛋白主要表達于高級別的膠質瘤中，且隨著組織分級的增加其表達率增加，提示其可能通過調節IGF-Ⅱ、CD44、基質金屬蛋白酶等參與了膠質瘤細胞生長過程；Ki-67在高級別膠質瘤(Ⅲ ～ Ⅳ級)中的 陽性表達率明顯高于低級別膠質瘤(Ⅰ ～ Ⅱ級)，提示隨著膠質瘤的級別及惡性程度的增高，腫瘤細胞的增殖能力增加。

綜上所述，IMP3及Ki-67在腦膠質瘤中的表達均與膠質瘤的惡性程度呈正相關。我們認為二者聯合應用可作為評價膠質瘤級別及判斷膠質瘤預后的重要指標。IMP3和Ki-67在膠質瘤細胞上的表達呈現正相關，但機制及通路有所不同，具體關系還需要增加病例量及采用先進觀察方法進一步深入研究。

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本刊編輯部

Expression and clinical significance of IMP3 and Ki-67 in hunman gliomas

ZHANGRan,WANGQuanyi,ZHANGJunchen，YUShanshan，WANGHaitao，AOQilin

(Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, China)

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of insulin-like growth factor II mRNA-binding protein 3 (IMP3) and Ki-67 in human brain glioma.Methods60 different grade of gliomas were selected from 2005 to 2012 in our hospital (grade I 5 cases, grade II 20 cases, grade III 20 cases, grade IV 15 cases) and 5 cases of normal brain tissue. The expression of IMP3 and Ki-67 was detemined in gliomas using immunohistochemistry (Envision method).. The correlation was analyzed between expression of IMP3, Ki-67 and malignant degree of gliomas. And the correlation between the expression of IMP3 and Ki-67 was also analyzed.ResultsThe expression of IMP3 in different grade gliomas was statistically significant (χ2=41.17,P<<0.05) and it was significantly higher in grade Ⅲ-Ⅳ gliomas than that in gradeⅠ-Ⅱ (91.4% vs. 8%, χ2=41.34,P<0.05). The range of Ki-67LI was 0%-50%. The expression of Ki-67 in different grade gliomas was statistically significant(χ2=29.80,P<0.05) and it was significantly higher in grade Ⅲ-Ⅳ gliomas than that in gradeⅠ-Ⅱ(91.4% vs. 20%, χ2=50.29,P<0.05). There was positive correlation between IMP3 and Ki-67 expression in brain gliomas (r=0.774,P<0.05).ConclusionThe expression of IMP3 and Ki-67 in gliomas was positive correlated with the grades of gliomas. The united application of them can be used as important reference index for evaluation of gliomas's biological behavior.

Insulin-like growth factor Ⅱ mRNA-binding protein 3; Nuclcear- associated antigen Ki-67; Brain glioma

* [基金項目]濟寧市科技局2012年計劃內科研項目(編號：2012 jnwk04)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.01.007

R363.2

A

1000-9760(2015)02-028-05

2014-12-11)