五種紅樹植物原位根系小分子多酚組成及含量分析*

劉 玉 洪澤珊 彭逸生 徐健榮

(1. 中山大學環境科學與工程學院 廣州 510275; 2. 廣東省環境污染控制與修復技術重點實驗室(中山大學) 廣州 510275)

紅樹植物是一類多酚(polyphenol)又稱單寧(tannin)含量較高的植物, 這一特性是紅樹植物在長期的自然選擇過程中與其獨特生境協同進化的結果,是紅樹植物能夠長期生存在潮間帶高鹽度、缺氧及酸性環境下的關鍵因素, 并成為紅樹植物在化學成分上的顯著特征(Chenet al, 2009; Wanget al, 2014)。

植物多酚分為水解單寧及其相關化合物和縮合單寧及其相關化合物。水解單寧(聚棓酸脂類多酚)包括棓單寧(水解后產生棓酸, 即沒食子酸)和鞣花單寧(水解后產生鞣花酸或其它與六羥基聯苯二酸有生緣關系的物質)。水解單寧在酸、堿或酶的作用下不穩定, 容易水解?？s合單寧(聚黃烷醇類多酚), 是黃烷醇的聚合物, 主要由黃烷-3-醇(包括表/阿福豆素、表/兒茶素、表/棓兒茶素)縮合而成(石碧等, 2000)。

水解單寧的主要最小單體為沒食子酸(gallic acid,簡稱 GA), 縮合單寧的主要最小單體為兒茶素(catechin, 簡稱C)、表兒茶素(epicatechin, 簡稱EC)、棓兒茶素(gallocatechin, 簡稱 GC)和表棓兒茶素(epigallocatechin, 簡稱 EGC)。這 5種最小單體是最重要的小分子多酚代表性單體, 具有重要的生態功能, 如植物的化感作用(Liuet al, 2013)。大量研究表明多酚類物質在不同植物群間化感作用中起到重要作用, 包括藻類、真菌、地衣、苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物(Inderjit, 1996)。研究美國東部入侵濕地環境最厲害的植物——蘆葦(Phragmites communis)對其它植被的化感作用機理, 發現其根泌物中最具化感活性的物質為沒食子酸, 其對多種植被系統包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)具有化感毒性(Rudrappaet al, 2007)。

紅樹植物對根際環境中的微型生物群落具有重要的控制作用, 可能與其根系分泌物有關(Kimuraet al, 1989; 李玫等, 2004; 李春強等, 2009)。紅樹植物根系含有大量的單寧酸, 而單寧酸具有溶藻的性質(Ayoubet al, 1985), 紅樹植物可能通過根系分泌物對底棲微藻具有抑制作用。

紅樹植物富含多酚類物質, 紅樹植物與根際微型生物群落之間存在較好的化感平衡作用。目前僅有少量研究對紅樹植物根泌物中的總酚和小分子酚酸進行測定, 但對紅樹植物根系中具體含有多酚類物質的種類尚缺少科學的證據。因此, 本研究選擇湛江高橋國家級紅樹林自然保護區進行原位采樣, 對5種紅樹植物根系進行 5種小分子多酚單體(micro molecule polyphenol monomers)(后簡稱為多酚單體)的定性及定量測定, 科學回答自然環境下紅樹植物根系多酚類物質的組成和含量特點, 對全面理解紅樹植物的生態作用具有重要的理論研究意義, 同時也可為紅樹林生態系統的科學管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域及采樣定位

采樣在湛江紅樹林國家級自然保護區研究基地進行, 該保護區是我國現存紅樹林連片面積最大的一個自然保護區, 高橋紅樹林保護區是其主要核心區域之一。對5種重要的建群紅樹植物群落在退潮時進行采樣, 為木欖(Bruguiera gymnorrhiza,Bg)、秋茄(Kandelia candel,Kc)、桐花樹(Aegiceras corniculatum,Ac)、無瓣海桑(Sonneratia apetala,Sa)群落及紅海欖(Rhizophora stylosa,Rs)群落, 并對低潮帶桐花樹(簡稱Ac-L)也進行采樣。每種紅樹植物群落內設置3個采樣點, 即選擇樹高相近之3株植物, 每株紅樹植物均用經緯度儀準確定位, 由于采樣面積較大, 范圍大致在 21°32′35.06″N, 109°46′09.01″E 間。

1.2 采樣時間與方法

采樣于2013年9月上旬進行。根系樣品采集: 根據不同紅樹植物根系特征采集紅樹植物支柱根頂部,將紅樹植物支柱根周圍的土刨開, 然后小心地將根系挖出, 抖落或輕輕刮下根系表面土, 混合根系樣品并裝入密封袋內冷凍保存。實驗室內洗凈后選取紅樹植物根尖10 cm以內的根段。真空冷凍干燥。

1.3 多酚類物質小分子單體測定方法

由于目前尚未發現有同時測定這 5種小分子多酚的文獻報道, 本研究對多篇文獻中的方法進行整合并改良(Bieriet al, 1979; Wanget al, 2003; Soonget al, 2006; Matilainenet al, 2011), 采用提取-純化-高效液相色譜(HPLC)測定步驟, 同時測定根系中其含量,預實驗結果顯示 5種小分子多酚色譜峰分離效果較好, 加標回收率均在60%以上。

(1) 提取和純化: 稱取0.2 g 100目根系凍干樣品于10 mL聚四氟乙烯離心管內, 加入3 mL 80%甲醇,45°C下水浴超聲30 min(超聲頻率為100 Hz), 8000 r/min轉速下離心10 min, 轉移上清液于試管中, 重復提取3次, 合并提取液后過濾至雞心瓶內, 取3 mL 80%甲醇溶液潤洗試管并過濾至雞心瓶。加10 mL高純水于雞心瓶中, 和提取液搖勻后旋蒸去除提取液中的甲醇, 將剩下的水提取液加等量乙酸乙酯進行萃取, 重復3次, 合并3次萃取獲得的乙酸乙酯相, 旋蒸至干,密封冷藏保存。上機前加入1 mL 20%甲醇溶液溶解,過0.45 μm濾膜。

(2) HPLC儀測定: 色譜條件: C18柱; 流動相A:0.1%(V/V)磷酸-水溶液; 流動相 B: 甲醇-0.1%(V/V)磷酸溶液。梯度洗脫: 0—15 min, 21% 流動相B; 15—20 min, 21%至50% 流動相B; 檢測波長210 nm; 進樣量: 10 μL; 流速: 1.0 mL/min; 柱溫: 30°C。所用試劑均為高效液相色譜純級別。

1.4 數據統計與處理方法

綜合使用 Excel(2003和 2007)、SPSS(17.0)、OriginPro(8)對數據進行平均值等的分析及圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 五種紅樹植物根系 5種小分子多酚定性和定量分析

按照前述提取方法和色譜條件, 對5種紅樹植物根系17個根樣凍干樣品中的5種小分子多酚單體進行了定性定量分析。5種小分子多酚能夠較好地分離以及定性定量, 表1和圖1分別為5種小分子多酚的保留時間及標樣的高效液相色譜圖。

表1 標樣中5種多酚單體的保留時間(min)Tab.1 Retention time (min) of 5 polyphenol monomers in standard sample

圖1 五種多酚單體標樣的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5 polyphenol monomers in standard sample

紅樹植物根系中 5種小分子多酚單體的高效液相色譜圖(17張譜圖中僅挑選桐花樹-L1一張展示)見圖2, 根據色譜圖中各色譜峰出峰時間對5種小分子多酚進行定性分析, 5種紅樹植物根系基本上全部含有這5種小分子多酚單體(17個樣品中應有85個峰,實際出現77個峰, 8個峰為0值)。

圖2 五種紅樹植物根系提取液中五種多酚單體的液相色譜圖(以桐花樹-L1為例)Fig.2 Chromatograms of 5 polyphenol monomers in root extracts of five mangrove plants (taking Aegiceras corniculatum-L1 as example)

再根據峰面積計算其含量, 進行分析, 如圖 3—圖7。

圖3 五種多酚單體在五種紅樹植物根系提取液中單株中最大值比較Fig. 3 Highest contents of 5 polyphenol monomers in root extracts in a single mangrove plant

圖4 每種多酚單體含量平均值在五種紅樹植物根系提取液中的比較Fig.4 Average content of each polyphenol monomer in root extracts of five mangrove plants

圖5 五種多酚單體平均值在五種紅樹植物根系提取液中的比較Fig.5 The average contents of 5 polyphenol monomers in root extracts of five mangrove plants

對5種紅樹植物單株根系提取液中5種小分子多酚最高值進行比較, 從圖3可以看出, 17個樣品中兒茶素(C)單株含量最高值出現在低潮帶桐花樹樣品(Ac-L3)中, 為1.7424 mg/gDW。棓兒茶素(GC)單株含量次高出現在秋茄樣品(Kc3)中, 為1.1470 mg/gDW。表 棓兒茶素(EGC)單株含量第 3出現在紅海欖樣品(Rs3)中, 為0.4457 mg/gDW。沒食子酸(GA)單株含量第4出現在木欖樣品(Bg2)中, 為0.2374 mg/gDW。表兒茶素(EC)單株含量排最后, 出現在秋茄(Kc3)樣品中, 為0.3331 mg/gDW。

對5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的3株樣品平均值進行比較, 見圖4。從圖4可以看出, 以秋茄樣品 棓兒茶素(GC)的平均含量最高, 3個樣品的平均值最高達1.0914 mg/gDW。低潮帶桐花樹樣品中, 以兒茶素(C)含量最高, 平均值最高達0.9650 mg/gDW。秋茄也含有最高的表兒茶素(EC)含量, 平均值最高值為0.2196 mg/gDW。紅海欖含有最 高的表 棓兒茶素(EGC)含量, 平均值最高值為0.1500 mg/gDW。木欖含有最高的沒食子酸(GA)含量,平均值最高值為0.1289 mg/gDW。

對5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的平均值進行比較, 見圖5。從圖5可以看出, 以秋茄(Kc)和低潮帶桐花樹(Ac-L)樣品5種小分子多酚含量平均值最高, 分別為0.2778 mg/gDW、0.2379 mg/gDW。木欖(Bg)、無瓣海桑(Sa)相差不大, 依次為 0.0766 mg/gDW、0.0734 mg/gDW。紅海欖(Rs)、桐花樹(Ac)最低, 平均值分別為0.0488 mg/gDW、0.0341 mg/gDW。

對5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的總平均值進行比較, 見圖6。從圖6可以看出, 以棓兒茶素(GC)的含量最高, 平均值最高達 0.2259 mg/gDW,兒茶素(C)含量次高, 平均值最高為0.2234 mg/gDW。表兒茶素(EC)含量第3, 平均值為0.0651 mg/gDW。沒食子酸(GA)含量第4, 平均值為0.0638 mg/gDW。表棓 兒茶素(EGC)含量最低, 平均值為0.0457 mg/gDW。

圖6 五種多酚單體總平均值含量比較Fig.6 Comparison of the total average contents of 5 polyphenol monomers

圖7 五種紅樹植物根系中五種多酚單體含量總圖Fig.7 Contents of 5 polyphenol monomers in root extracts of five mangrove roots

對5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的總體狀況進行比較, 見圖7。從圖7可以看出, 以秋茄(Kc)三株植物的5種小分子多酚含量最高, 其中以 棓兒茶素(GC)為主。低潮帶桐花樹(Ac-L)樣品有 2株分子多酚含量最高, 其中以沒食子酸(GA)為主。無瓣海桑(Sa)三株含量相差不大, 以沒食子酸(GA)和兒茶素(C)相對含量較高。桐花樹(Ac)、紅海欖(Rs)、木欖(Bg)單株含量相差較大, 其中有1株相對含量較高。

2.2 紅樹植物根系小分子多酚組成特點及生態功能

許多研究顯示植物分泌的次生代謝物質對水體中的微藻能產生化感抑制作用(Muratovaet al, 2009;Zhuet al, 2010), 且分析檢測結果多發現, 有效抑藻成分大多屬于多酚類物質。穗花狐尾草(Myriophyllum spicatum)提取物對銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)存在抑制作用, 在其提取物中檢測出多種多酚類物質,包括沒食子酸、連苯三酚、兒茶素、鞣花酸、阿魏酸等(Planas, 1981; Nakaiet al, 2000)。14種多酚中有10種具有抑藻作用, 且兒茶素和對苯三酚的抑藻效應最強(Nakaiet al, 2001)。蘆葦的腐爛提取液中含有8種多酚類物質, 其中芥子酸、丁香酸、咖啡酸和沒食子酸等4種多酚具有很強的抑藻性(Nakaiet al, 2006)。近年研究結果顯示, 焦棓酚(pyrogallol)或焦棓酸(pyrogallic acid)對M. aeruginosa和Cylindrospermopsis raciborskii的生長、氧化壓力及基因表達都起到作用(Shaoet al,2009; Wuet al, 2013)。

對 14種植物多酚的抑藻效果進行分析, 發現其抑藻效能與其酚羥基的數量及酚羥基的取代位置相關, 擁有 2—3個酚羥基的植物多酚抑藻效果最顯著(Nakaiet al, 2001; Sunet al, 2010)。沒食子酸和(+)-兒茶素對赤潮藻塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的化感作用比香草醛強, 可能是因為沒食子酸和(+)-兒茶素的苯環上都存在3―5個羥基, 而香草醛僅存在1個羥基(楊維東等, 2005)。

有研究顯示某些低分子量的多酚對某些微生物具有較強的抑制能力, 包括沒食子酸和兒茶素,甚至比單寧酸和茶單寧的抑制能力還強, 原因可能是某些具有毒性的低分子多酚易于透過微生物膜直接對其細胞的代謝作用產生影響, 使得低分子量的多酚毒性可能比單寧還強(石碧等, 2000; Xieet al, 2013)。

本研究證實紅樹植物根系中普遍含有 5種重要的小分子多酚單體, 有些還具有相當高的單株含量,如兒茶素(C)最高可達1.7424 mg/gDW, 棓兒茶素(GC)最高為 1.1470 mg/gDW, 表棓兒茶素(EGC)0.4457 mg/gDW, 沒食子酸(GA)0.2374 mg/gDW, 表兒茶素(EC)0.3331 mg/gDW。這些低分子量的具有多個羥基的小分子多酚是否會以根系分泌物的形式進入到根際環境從而對紅樹植物根系微型生物群落起到重要調控作用, 以及其調控機理和相關效應大小, 有待進一步深入分析。

3 結論

湛江紅樹林國家級自然保護區 5種重要的建群紅樹植物根系基本上全部含有5種小分子多酚單體, 濃度含量范圍在0.0007—1.7424 mg/gDW。單株含量最高值分別為, 低潮帶桐花樹兒茶素為1.7424 mg/gDW, 秋茄棓兒茶素為 1.1470 mg/gDW, 紅海欖表 棓兒茶素0.4457 mg/gDW, 木欖沒食子酸 0.2374 mg/gDW, 秋茄表兒茶素0.3331 mg/gDW。5種小分子多酚含量的總平均值以秋茄和低潮帶桐花樹最高, 分別為0.2778 mg/gDW、0.2379 mg/gDW。木欖和無瓣海桑次之, 依次為0.0766 mg/gDW、0.0734 mg/gDW。紅海欖和桐花樹相對最低, 分別為 0.0488 mg/gDW、0.0341 mg/gDW。五種紅樹根系內均檢測出5種小分子多酚單體, 對全面理解和闡述紅樹植物的化感作用和生態功能具有重要意義。

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