杭州西溪濕地沉積物細菌的群落結構和多樣性*

黃 媛 方 序 褚文珂 陳 敏①

(1. 杭州師范大學生命與環境科學學院 杭州 310036; 2. 浙江省微生物研究所 杭州 310012)

濕地是位于水陸交界處形成的獨特的生態系統。濕地生態系統中, 沉積物是一個由各種微生物參與的、物質發生頻繁交換的、具有高度生物活性的特殊生境(徐長君等, 2009)。沉積物中微生物的多樣性對整個水體系統有重要影響(何建瑜等, 2013)。與水體中的懸浮微生物比較, 沉積物微生物往往在單位數量和功能多樣性上更為豐富(Klammeret al, 2002),因此對水體生態系統平衡的重要性也更大。目前, 沉積物微生物正受到越來越多研究者的關注(任麗娟等,2013)。Li等(2011)利用熒光原位雜交方法(fluorescence in situ hybridization, FISH)和變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術,研究了海底表層沉積物中細菌的群落結構, 發現屬于 β-變形菌綱(β-Proteobacteria)的氨氧化菌(AOB)的豐度達到了(1.87—3.53)×105cells/g, 其群落結構組成與沉積物的鹽度、溫度、呼吸作用和總有機碳(TOC)等因子密切相關, 可以作為海域沉積物硝化作用的間接指示因子。時玉等(2014)利用定量 PCR(qPCR)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術, 對青藏高原淡水湖普莫雍錯和鹽水湖阿翁錯湖底沉積物進行細菌多樣性的比較研究, 結果發現青藏高原淡水與鹽水湖泊沉積物細菌豐度與群落結構具有明顯的差異; 同時, 沉積物細菌群落結構在不同深度也表現出差異。

杭州西溪國家濕地公園位于杭州市區西部, 是在自然濕地基礎上由一千多年農漁耕作用下形成的罕見的城中次生濕地, 曾經的稻、桑(柿)、魚、蠶的農業模式是西溪濕地的一大特色。近 20多年來, 隨著經濟和社會的發展, 西溪濕地的面積由原來的60km2萎縮到現在的不足 12km2, 并且因為人類活動的日趨頻繁, 濕地的生態系統也遭到了不同程度的破壞(陳久和, 2003)。在此背景下, 2003年正式啟動了西溪濕地綜合保護工程, 到2008年保護工程一、二、三期基本建成并投入使用。西溪濕地植物園是西溪國家濕地公園二期建設的一部分, 其目標是通過恢復一定比例的濕地植物群落, 將原來大面積的魚塘-基-渚濕地演變成典型的濕地景觀, 形成自然的濕生生態系統, 這對于西溪濕地的保護和修復有著重要的實踐意義。本文以西溪濕地植物園區域內不同水生植物生境下的表層沉積物為研究對象, 采用MiSeq高通量測序的方法, 研究沉積物中細菌的群落特征和多樣性, 以期為豐富西溪濕地生態系統內涵, 開發西溪濕地的微生物資源, 進而為西溪濕地的保護和修復提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品

沉積物樣品于2014年6月采自杭州西溪國家濕地公園保護區濕地植物園野外觀測樣地(120°4′18″E,130°16′26″N)。濕地植物園的群落構建遵循了優勢種培育模式, 即在大面積寬闊的水域大量種植一種或數種水生植物, 發展大面積的優勢群落。選擇的水生植物主要包括: (1) 挺水植物群落(蒲葦, 白茅等);(2) 浮水植物群落(睡蓮, 鳳眼蓮等); (3) 沉水植物群落(金魚藻, 狐尾藻等); (4) 濕生植物群落(美人蕉,黃菖蒲等)。以上述 4類不同水生植物生境下的表層沉積物(0—10cm)為研究對象, 每種類型的樣品進行3個重復采樣, 即每個樣點距離 2m以上隨機取點,混勻后樣品編號為1—4號。采集后的樣品迅速放入無菌保鮮袋中, –20°C 保存。

1.2 土壤理化性質測定

沉積物pH值采用測定其間隙水的方法, 稱取數克沉積物樣品, 離心, 取上清液, 用pH計測定其pH值?？傆袡C碳含量采用Analytik multi N/C 3100分析儀測定; 總氮含量采用 EURO EA元素分析儀測定;總磷含量采用 H2SO4-HClO4雙酸消煮-鉬銻抗比色法測定(趙亞杰等, 2015)。

1.3 高通量測序及數據分析

1.3.1 MiSeq高通量測序 用EZNA Soil DNA Kit(OMEGA公司)提取基因組DNA, 對16S rRNA V3、V4 區進行擴增, 引物: 338F (5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCA-3′); 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)。PCR 擴增反應體系(20μL): 5×FastPfu Buffer 4μL, 2.5mmol/L dNTPs 2μL, Forward Primer (5μmol/L)0.4μL, Reverse Primer (5μmol/L) 0.4μL, FastPfu Polymerase 0.4μL, Template DNA 10ng。反應條件:94°C預變性 120s, 94°C 變性 30s, 55°C 退火 30s, 72°C延伸45s; 28個循環。每個樣品3個重復, 將同一樣品的 PCR產物混合后用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收 PCR產物,Tris-HCl洗脫, 2%瓊脂糖電泳檢測。

參照電泳初步定量結果, 將 PCR產物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量, 之后按照每個樣品的測序量要求, 進行相應比例的混合, 委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行 Illumina MiSeq高通量測序(李靖宇等,2014)。

1.3.2 測序數據優化處理 為了保證后續生物信息學分析的準確性, 對測序數據進行質量控制。通過過濾 read尾部質量值 20以下的堿基, 利用Trimmomatic、FLASH等軟件篩選拼接序列的overlap區錯配比率低于0.2, barcode錯配數為0, 最大引物錯配數為2的優化序列進行后續分析。

1.3.3 OTU聚類分析及分類學分析 利用Usearch(vsesion 7.1 http: //qiime.org/)軟件平臺, 在97%的相似水平對所有序列進行可操作分類單元(OUT)劃分。為了得到每個OTU對應的物種分類信息, 采用RDP法(Wanget al, 2007)(置信度閾值為0.7)對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。比對數據庫為16S細菌數據庫: Silva (Release115 http: //www.arbsilva.de)。

1.3.4 群落a多樣性分析 基于優化處理的 OTUs及相關分析軟件Mothur (version v.1.30.1 http: //www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha diversity)繪制了各樣品的稀釋曲線, 并在重取樣的基礎上計算了種群豐富度指數 Chao值(http: //www.mothur.org/wiki/Chao)和物種多樣性指數 Shannon-Wiener指數(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)。

2 結果與分析

2.1 沉積物理化性質

沉積物中的總有機碳、總氮和總磷等含量是反映營養狀況和污染程度的雙重指標。表 1結果顯示, 4個沉積物樣品的理化特性有較大的差異, 其中總有機碳和總氮最高的是1號挺水植物生境樣品, 其次是4號濕生植物生境樣品; 而總磷最高的是4號濕生植物生境樣品, 其次是1號挺水植物生境樣品。2號浮水植物和3號沉水植物生境樣品無論是總有機碳、總氮還是總磷明顯低于1號挺水、4號濕生植物生境樣品。樣品的pH均偏酸性, 其中2號浮水植物生境樣品的pH為5.17, 酸性最強。

表1 西溪濕地沉積物樣品理化性質Tab.1 Physicochemical parameters in Xixi sediment

圖1 各樣品優勢細菌群落結構Fig.1 Dominant bacterial community of each sample at the genus level

2.2 沉積物樣品主要細菌類群分布

采用RDP法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析, 在數據庫中沒有相應分類單元的序列, 以norank標記。結果表明, 沉積物樣品具有很高的細菌多樣性。在門的水平有變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、螺旋菌門(Spirochaetae)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)等 30個門(數據未顯示)。在屬的水平上共鑒定有252個屬(圖1所示, 已將豐度極低的部分合并為other在圖中顯示), 其中豐度較高且所有樣品均有分布的主要有鐵桿菌屬(Ferribacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、厭氧粘細菌屬(Anaeromyxobacter)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、螺旋體屬(Spirochaeta)、硫堿螺旋菌屬(Thioalkalispira)、Sulfuritalea屬、泉發菌屬(Crenothrix)、互養菌屬(Syntrophus)和Pseudorhodoferax屬。1號和4號的優勢類群為鐵桿菌屬, 含量分別為8.29%和12.30%; 2號和3號的優勢類群是乳球菌屬,含量分別為13.52%和8.87%。有些細菌類群僅在特定的樣品中出現, 如 1號樣品特有的菌群包括醋菌屬(Actibacter)、貝日阿托氏菌屬(Beggiatoa)和Ferruginibacter屬等6個屬; 2號樣品特有的菌群有鐵氧化細菌(Ferritrophicum)、纖維堆囊菌(Sorangium)和新衣原體屬(Neochlamydia)等10個屬; 3號樣品特有的菌群只有蛭弧菌屬(Bdellovibrio); 4號樣品特有的菌群有甲基暖菌屬(Methylocaldum)和Propionivibrio屬。這些特有的菌群通常豐度較低。此外, 尚有未培養(Uncultured)和未分類(Unclassified)細菌類群, 前者占比在30%—50%, 后者占比在10%—20%。說明西溪濕地沉積物中蘊藏有較多的潛在新物種。

2.3 沉積物樣品細菌群落α-多樣性

利用高通量測序技術, 過濾掉低質量的序列后,4個樣品共獲得有效序列 67734條, 根據 barcode標簽進行樣品序列拆分, 并對初始序列進行去冗余處理以獲得16S rDNA Unique Reads, 在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的 OTU , 統計各樣品在不同OTU 中的豐度信息, 4個樣品共產生2181個OTU,經優化處理后, 得到平均長度為441 bp的序列, 其中片段長度>400 bp的序列數占到了總序列數的99.74%。各樣品Reads和OTU數量如表2所示。

采用對測序序列進行隨機抽樣的方法, 以抽到的序列數與它們所能代表的數目構建稀釋性曲線(圖2)。從圖2中可以看出, 4個樣品的稀釋曲線在0.97相似性水平下趨于平坦, 但仍未達到飽和。因此, 為了判斷這些數據量是否合理, 繪制了各樣品的 Shannon-Wiener曲線(圖 3), 結果顯示, 開始時曲線直線上升,是由于測序條數遠不足覆蓋樣品; 當測序數值增至2000以上時, 曲線趨向平坦并達到了平臺期, 說明 4個樣品的測序量足以覆蓋樣品中的絕大部分微生物。

圖2 各樣品的稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of each sample

圖3 各樣品微生物Shannon-Wiener曲線Fig.3 Shannon-Wiener curves of each sample

表2 不同樣品細菌群落的多樣性指數Tab.2 The diversity index for bacterial community in different samples

由于測序系統本身的缺陷, 雖然在上樣測序前,已對各樣品的3個重復PCR產物進行了混合, 但每個樣品所測出的序列數目仍不一致(表2)。而OTU數和Chao指數會受到序列數的較大影響, 因此有必要對每個樣品進行重取樣。根據圖3的Shannon指數研究結果, 確定每個樣品隨機重取樣序列數為 4823條。通過 Mothur軟件計算各樣品的 α-多樣性指數, 指數值越大, 表明細菌群落多樣性越高。結果顯示, 4個樣品的Chao 指數和Shannon指數均較大, 其中2號樣品的豐度最高多樣性最高, 4號樣品其次, 1號和3號樣品相對較低。

2.4 沉積物樣品細菌群落結構相似性比較

對4個樣品的OTU進行統計, 其中1號樣品454個, 2號樣品567個, 3號樣品472, 4號樣品483個。維恩圖結果顯示(圖4), 4個樣品共有的OTU為224個, 占總數的11.34%。1號和4號樣品間共有的OTU為264個, 2號和3號樣品間共有的OTU為293個, 比其他樣品間共有OTU數目都要多, 表明1號與4號樣品, 2號與3號樣品之間的細菌群落結構較為相似。

同樣, 利用樹枝結構描述和比較4個樣品間的相似性和差異關系(圖5), 結果表明, 1號和4號樣品的細菌群落結構組成及豐度相對接近而聚在一個分枝,同樣2號和3號樣品相似性較高聚在另一分枝上, 末端豎線表示樣品聚在一起相似度較高。此分析結果與維恩圖結果一致。

圖4 OTU分布Venn圖Fig.4 Venn diagram showing the unique and shared OTUs (3%distance level)

圖5 多樣品相似度樹狀圖Fig.5 Multiple samples similarity tree

3 討論

3.1 沉積物的細菌多樣性

微生物是濕地生態系統的主要分解者, 推動系統的物質循環和能量流動, 對維持生態平衡、涵養水源、調節氣候、降解污染物等方面起著十分重要的作用。研究濕地生態系統微生物的變化規律及群落結構,有助于更深層次了解濕地微生物多樣性及濕地生態系統結構和功能。目前國內關于濕地微生物的研究已有較多的報道, 大多采用基于 PCR的構建克隆文庫方法、變性梯度凝膠電泳(DGGE)及熒光原位雜交(FISH)等技術。本研究采用高通量測序技術, 首次對西溪濕地 4個不同植被下沉積物樣品的細菌群落組成進行了比較分析, 結果表明, 沉積物中具有很高的細菌多樣性, 鑒定到的共有30門 252屬。其中變形菌門(Proteobaeteria)是最優勢的菌群, 在 1號至 4號樣品中的所占比例分別為 64.7%、31.0%、31.5%和53.3%。據報道, 變形菌門在各類環境包括水體沉積物中普遍存在, 是細菌中最大的類群(Cifuenteset al,2000; Madridet al, 2001)。Ravenschlag 等(2001)分析北極群島海洋沉積物微生物群落結構時發現, γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)和 δ-變形菌綱(δ-Proteobacteria)在變形菌門類群中占主導地位; Li等(2009)用 16S rRNA基因文庫的方法, 分析了南海地區的表層沉積物細菌的多樣性, 研究結果也同樣支持這一觀點。本研究也得到了相似的結果, 變形菌門中以 β-變形菌綱、γ-變形菌綱及δ-變形菌綱為優勢類群, 這些菌群具有極為豐富的代謝多樣性, 在西溪濕地沉積物的C、N、S、Fe等元素循環中發揮著重要功能。

根據研究, 與氮素循環密切相關的硝化細菌分散在變形菌門中的 α、β、γ、δ類, 當環境中大量氨存在時, 這類細菌的數量將會較多。本研究中4個沉積物樣品硝化細菌的類群主要分布在亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae_uncultured)、Nitrospinaceae_uncultured和硝化螺菌科(Nitrospiraceae_uncultured),其中硝化螺菌科是硝化細菌的優勢種群, 尚屬未培養類群。

硫氧化細菌和硫(或硫酸鹽)還原細菌都是硫素循環的重要菌群, 主要分布于變形菌門中的 β、γ類, 通過鑒定, 4個樣品都有且為優勢種屬的硫氧化細菌是硫桿菌屬(Thiobacillus); 硫堿螺旋菌屬(Thioalkalispira)只在樣品2、3中發現, 貝日阿托菌屬(Beggiatoa)只在樣品 1中存在。而硫(或硫酸鹽)還原細菌的優勢種群是脫硫盒菌科(Desulfarculaceae_uncultured), 其次是脫硫葉菌屬(Desulfobulbus)、桿狀脫硫菌屬(Desulforhabdus)、Desulfocapsa屬、Desulfobacca屬和脫硫單胞菌目(Desulfuromonadales_unclassified)。硫酸鹽還原細菌通常生活在含有豐富有機質和高含量硫酸鹽的水體或沉積物中(Higashiokaet al, 2013), 據報道, 被還原的S-2能與沉積物中的多種重金屬離子如Zn2+、Cu2+、Hg2+及Pb2+等形成溶度很小的金屬硫化物, 重金屬硫化物的沉淀是沉積物固定重金屬的主要機制(王文卿等, 1999)。

甲烷營養菌大部分屬于 γ變形細菌, 種類多樣,在碳循環中有重要作用, 能夠將甲烷分解后轉化為細胞物質。4個樣品中鑒定到的甲烷營養菌類群主要有甲基桿菌屬(Methylobacter)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、甲基微球菌屬(Methylomicrobium)、甲基暖菌屬(Methylocaldum)、Methylogaea屬、Methylotenera屬、甲基球菌科(Methylococcaceae_unclassified)和嗜甲基菌科(Methylophilaceae_uncultured),其中甲基桿菌屬(Methylobacter)是所有甲烷營養菌的優勢種屬。

綠彎菌門是本研究中的第二大類群, 在1號至4號樣品中的占比分別是7.0%、24.9%、43.0%和13.5%。這類細菌通過光合作用產生能量, 兼性厭氧, 有些類群為專性厭氧菌(Grégoireet al, 2011)。綠彎菌主要分布于深海和湖泊有機物豐富的沉積物中, 在許多相關的研究中頻繁被發現(魏曼曼等, 2012), 但有關綠彎菌功能特性的報道較少, Bj?rnsson等(2002)實驗證明, 綠彎菌確實是活性污泥的組成成分之一; 楊小麗等(2013)研究發現, 綠彎菌與 COD 去除具有較好的相關性; Sorokin等(2012)也發現, 綠彎菌可能與亞硝酸鹽氧化作用有關; 曹新塏等(2012)對工業廢水中的萘進行高效生物處理時發現, 屬于綠彎菌門的Levilinea對于染料中的萘有一定的去除作用。因此推測, 作為西溪濕地沉積物的優勢菌群之一, 綠彎菌在濕地環境污染物的降解方面可能發揮有重要作用。

此外, 本研究的4個樣品中約有10%—15%的序列屬于無法確定分類位置(Unclassified)的類群, 這些細菌很可能是新的細菌分類單元, 另有30%—50%的序列與未培養細菌具有高度相似性, 表明濕地中存在大量未知的功能菌群。以上結果反映了西溪濕地沉積物中獨特的細菌組成, 同時也揭示了沉積物中有許多菌種資源尚待發掘和認知。

3.2 細菌多樣性與環境因素的關系

物種多樣性是評價群落質量的重要指標, 本研究采用Chao 指數和Shannon指數對細菌群落結構進行綜合分析。從分析結果來看, 4個樣品的Chao 指數和Shannon指數均較大, 表明西溪濕地水生植物園的沉積物中細菌群落的豐度和多樣性較高, 這一結果可能與沉積物富含有機物等營養物質有關。有實驗表明, 在土壤營養物質豐富時, 微生物群落的數量、生物量等與土壤有機碳、總氮等呈明顯正相關(Córdova-Kreyloset al, 2006)。本研究中, 4個沉積物樣品中有機碳豐富, 其含量在 18.16—49.31mg/g, 總氮、總磷含量也較高, 前者 4.73—9.42mg/g, 后者 0.25—0.91mg/g。說明細菌對富營養生境有一定的耐受性,一定程度的富營養有利于細菌的生長和繁殖, 導致群落結構復雜, 多樣性更豐富; 但如果富營養過度,也可能對一些敏感類群產生抑制作用, 或是豐富的營養促進了特定幾類細菌的大量生長, 從而限制了其他許多細菌的生長(鄭艷玲等, 2012), 如 1號樣品的有機碳、總氮和總磷含量顯著高于2號和3號樣品(表1), 但前者的豐度及多樣性指數反而較低。

從相似性分析來看, 1號與4號樣品, 2號與3號樣品之間的細菌群落結構及豐度較為相似(圖4和圖5)。1號和 4號樣品的優勢種屬是鐵桿菌屬(Ferribacterium),相對豐度分別是8.29%和12.30%。據報道, 在缺氧的湖泊沉積物中, Fe+3的還原作用通常會普遍發生,Ferribacterium能將 Fe+3還原成 Fe+2, 導致鐵從水生生境中的轉移(Cumminget al., 1999)。據此推測, 樣品1和4的生境中可能都富含鐵, 從而使鐵桿菌成為優勢種群。2號和 3號樣品的優勢種屬是乳球菌屬(Lactococcus), 相對豐度分別是13.52%和8.87%。乳球菌是一類耐氧菌, 其適宜生長的生境一般是植物體, 據此推測, 2號和3號沉積物中乳球菌數量較多可能與采樣地的水生植物相關, 至于其在沉積物中的生態學意義少見報道, 需進一步的研究確定。因此,細菌的群落結構和多樣性, 還可能與采樣地植物種類和生長狀況有關。在有水生植物的環境中, 水生植物的殘體及根系代謝物等也可能對沉積物中細菌的種屬多樣性產生影響?？傊? 濕地沉積物是一個非常復雜的生態系統, 各種環境因子、生物因子相互作用和影響, 很多情況下并不能用簡單的單因子之間的相關性來描述其和微生物之間的關系, 沉積物綜合環境條件的差異, 才是導致其多樣性和優勢微生物種屬發生變化的根本原因。對這方面的研究, 必須進行多年的試驗觀察, 才能比較全面地分析微生物和環境因子之間的相互作用。

3.3 微生物多樣性的研究方法

微生物群落多樣性的研究主要涉及對生態系統中微生物的種類、豐度、分布均勻性和結構變化等的解析, 但傳統的純培養技術因其方法具有較大的局限性, 很難體現自然生境中的微生物群落特征(王保軍等, 2013)。因此, 在過去的40多年里, 微生物多樣性的研究方法已經從傳統的培養分離發展到了無需依賴純培養的現代分子生物學技術。這些技術主要包括核酸雜交法、DNA指紋圖譜技術和宏基因組學等。核酸雜交技術(如FISH和DNA芯片技術)對環境中具特殊功能微生物的鑒定非常有效, 但是由于目前尚無法得到所有環境微生物的探針序列, 因此有一定的局限性?；蛑讣y圖譜技術包括末端限制性片斷長度多態(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)、DNA單鏈構象多態性(single strand conformation polymorphism, SSCP)等, 由于具有操作簡便以及可同時分析多個樣品的優點, 已經被廣泛地用于環境微生物群落結構和多樣性評價以及動態監測(Singhet al, 2011; Dinget al, 2012), 但同時每種方法幾乎都有缺點, 例如SSCP的重現性較差;對于超過500bp的DNA片段, DGGE的分離靈敏度會降低等等。

1998年Handelsman等首次提出宏基因組學的概念(Handelsmanet al, 1998)。高通量測序技術作為宏基因組學最成熟的關鍵技術, 其全面性、準確性以及信息的深入程度都令其他技術無法企及(孫欣等,2013)。本研究利用 Illumina Miseq高通量測序技術,對西溪濕地4個采樣點沉積物的細菌多樣性進行了分析, 鑒定出細菌 OTU達到 2181個, 這是其他方法很難實現的。但如何從這些海量數據中挖掘有效信息成為一大難題, 即生物信息學的發展將成為微生物研究的瓶頸。最近, Deng等(2012)基于宏基因組學技術的高通量數據成功構建了分子生態網絡(Molecular Ecological Networks, MENs), 該網絡可根據數據固有特性自動選擇閾值, 可較好地反映環境中微生物之間的相關性, 并且對高通量技術普遍存在的高噪音問題有很好的耐受性?？傊? 每種技術都有各自的局限性, 因此將兩種不同的方法結合起來進行綜合研究, 將是今后發展的方向(孫欣等,2013)。

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