細胞穿膜肽轉導大型海藻及對其光合作用的影響*

韋一凡 郇 麗 牛建峰 何林文 黃愛優張寶玉 林阿朋 王廣策①

(1. 實驗海洋生物學重點實驗室 中國科學院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京 100049)

細胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPPs), 也稱為蛋白轉導域, 是一種可以自發跨膜進入細胞的多肽(Lindgrenet al, 2000)。這種蛋白跨膜轉導現象最初是在研究 HIV-1病毒上的 Tat蛋白時被發現的(Frankelet al, 1988)。CPPs能夠介導熒光素、GFP、DNA、siRNA以及質粒等進入細胞, 該方法已經被廣泛應用在動物細胞的研究方面(Guptaet al, 2005;Turneret al, 2005; Crombezet al, 2008)。目前CPPs關于植物細胞的應用較少(Parket al, 2000; M?eet al,2005; Chughet al, 2009)。在藻類方面, 現有的CPPs研究主要集中在微藻(Liuet al, 2008; Hymanet al,2012; Sureshet al, 2013)。Hyman 等(2012)應用細胞穿膜肽八聚精氨酸和九聚精氨酸, 成功地將小分子、蛋白質以及酶轉導入野生型的萊茵衣藻。與傳統的外源物質轉導方法(如基因槍法)相比, 應用細胞穿膜肽不僅能夠避免制備原生質體, 而且還具有操作簡易、可規?；?、不會造成細胞物理損傷等優點。然而, 如今尚不清楚已成功應用于微藻的CPPs是否能夠同樣應用于大型海藻。大型海藻與微藻的結構有很大區別,前者具有更厚的細胞壁, 多糖等成分含量更加豐富,細胞壁結構也更復雜(Popperet al, 2011)。有些大型海藻如海帶(Laminaria japonica)富含膠質, 對外源物質的轉入有更強的阻礙作用。目前還未見CPPs應用于大型海藻的相關報道。

作者選取三種具有代表性的大型海藻, 分別是滸苔(Ulva prolifera)、紫菜(Porphyra yezoensis)和海帶(Laminaria japonica), 應用細胞穿膜肽九聚精氨酸(R9)對其進行細胞穿膜實驗。結果顯示九聚精氨酸可以高效的共價連接熒光素導入三種大型海藻細胞。與此同時, 對細胞穿膜肽處理后的三種大型海藻進行光合作用效率的檢測, 結果表明細胞穿膜肽 R9對三種大型海藻的光合效率均無影響。因此, 對于大型海藻來說, 細胞穿膜肽是一種安全高效的分子手段。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中的大型海藻材料(滸苔、條斑紫菜葉狀體、條斑紫菜絲狀體、海帶孢子體、海帶雌雄配子體)均來自于實驗室培養。培養溫度為18°C, 光照為60 μmol photons/(m2·s), 光暗周期設為 12h︰12h。

細胞穿膜肽九聚精氨酸(RRRRRRRRR, R9)及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的九聚精氨酸(FITC-R9)合成于吉爾生化有限公司(GL Biochem, China), 采用ABI433自動多肽合成儀,依據Fmoc標準固相合成法, 并用HATU作為肽偶聯試劑(Athertonet al, 1989)。單獨的異硫氰酸熒光素(FITC)購于Sigma-Aldrich有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞穿膜肽R9導入大型海藻 選取健康的藻體, 用吸水紙將表面海水吸干, 稱取兩份等重的藻絲, 分別為實驗組和對照組, 備用; 取兩只1.5 mL的Eppendorf離心管, 將兩組藻體分別轉移至兩只離心管中; 加入500 μL的PBS溶液, 5000 r/min離心1 min,傾去上清; 在避光室溫條件下, 在實驗組中加入500 μL濃度為50 μmol/L的FITC-R9溶液, 同時, 在對照組中加入500 μL濃度為50 μmol/L的FITC溶液; 室溫避光條件下處理10 min; 10 min后, 實驗組和對照組均5000 r/min離心1 min, 傾去上清; 兩組均加入500 μL的PBS, 5000 r/min離心1 min, 傾去上清, 重復三次, 得到處理完成的藻體, 備用。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察拍照 將處理后藻體置于載玻片上, 加入適量 PBS溶液, 蓋上蓋玻片,對蓋玻片周邊進行封片; 將已制成片的玻片倒置放在激光共聚焦顯微鏡的載物臺上; 設置參數, 選取雙通道, 分別應用488 nm和663 nm的激發光波長。對于實驗組和對照組, 所有的設置保持一致, 選取合適的視野, 觀察拍照。

1.2.3 CPPs導入大型海藻后光合效率變化的測定選取狀態良好的滸苔、紫菜和海帶, 每種藻取三等份;配制等量的PBS溶液, 50 μmol/L的R9溶液, 50 μmol/L的FITC-R9溶液, 對藻體進行處理, 處理時間為10 min;藻體暗適應 5—10 min, 將 Dual-PAM-100熒光儀與裝有相應配置軟件的電腦相連, 在室溫下測量 PSII的葉綠素熒光(Chl fluorescence of PSII)和P700的氧化還原狀態(the redox state of P700)。具體的設置參數為: 測量光來自620 nm波長的發光二極管(LED); 光化光來自 460 nm的 LED, 光強設置為 100 mmol photons/(m2·s), 持續時間為 5 min; 飽和光脈沖光強為 10000 mmol photons/(m2·s), 持續時間為 300 ms。將暗適應后的藻體夾在Dual-PAM的測量探頭上, 平衡后, 開始測量; 測得一系列參數后由Dual-PAM軟件推導得出最大量子產率Fv/Fm、光系統I的電子傳遞速率 ETR(I)以及光系統 II的電子傳遞速率ETR(II)。滸苔、紫菜和海帶每一組均有三個平行樣品, 所有樣品測量時的設置參數均一致。測量后的樣品, 等待3 h后, 按照上述步驟, 重新測量一遍。

2 結果與分析

2.1 CPPs導入大型海藻

如圖1所示, 熒光標記的R9能夠進入三種大型海藻細胞。其中圖中紅色部分代表藻體的葉綠體自發熒光, 綠色部分則是細胞穿膜肽上的熒光標記在488 nm激光激發下所顯示的顏色。由圖中可以看出, 紫菜的葉狀體(圖1a)和海帶的雌配子體(圖1b)的細胞穿膜肽作用效率最高, 部分 CPPs被細胞壁阻礙在細胞外,大部分的 CPPs進入藻細胞內, 定位在葉綠體周圍。經CPPs處理后的滸苔藻體(圖1e)顯示出明顯的綠色熒光, 仔細觀察后發現大部分綠色熒光位于細胞壁上, 也就是說在作用于滸苔時, 小部分的 CPPs進入了細胞內部, 大部分被阻隔在外。對照組單獨的FITC處理三種大型海藻, 沒有顯示綠色熒光, 說明單獨的FITC不能進入大藻細胞。

考慮到大型海藻不同生活史狀態下細胞壁的結構可能有所不同, 作者對不同生活史狀態下的紫菜和海帶進行了細胞穿膜肽導入。在紫菜方面, 雖然其葉狀體(圖1a)的細胞內部可觀察到明顯綠色熒光, 但是其絲狀體的細胞穿膜肽作用效率偏低。如圖1d所示, 大部分的絲狀體細胞是被綠色熒光所包圍著的,真正進入細胞內部的比例較少, 這間接說明紫菜葉狀體和絲狀體的細胞壁結構可能存在一定差異。在海帶方面, 考慮到不同性別的細胞可能會存在細胞壁的差異或者存在不同的內在轉運機制, 作者對海帶的雌、雄配子體的CPPs轉導效率進行了對比。結果顯示, 與雌配子體(圖 1b)相比, 海帶雄配子體(圖 1c)的 CPPs轉導效率要低的多, 綠色熒光絕大多數分布在雄配子體的外圍, 幾乎沒能進入細胞。這種現象可能是由于海帶雌配子體的細胞壁滲透性比精子細胞的更大, 或者可能是卵細胞存在更為高效的內部運輸機制。與此同時, 海帶的孢子體也被檢測(圖 1f),圖中顯示海帶孢子體的表皮細胞有著少量的CPPs攝入, 這可能是由于海帶的孢子體含有大量的膠質, 從而形成了更加強大的屏障, 阻礙外源物質的進入。

細胞穿膜肽進入動物細胞后有向細胞核移動的趨勢(Frankelet al, 1988), 這在大型海藻中也有所體現。CPPs處理紫菜的葉狀體后, 細胞內的綠色熒光趨向集中于一點(圖1a), 這一點有可能就是紫菜細胞核的位置。在海帶的雌配子體中也能夠觀察到類似的現象(圖 1b)。

2.2 CPPs處理大藻后的光合作用效率測定

Fv/Fm代表著光系統II的最大量子產率, 它是用來評價植物體光合作用表現的一個敏感參數, 當植物體受到外界脅迫時,Fv/Fm的值會急劇下降(Maxwellet al, 2000)。ETR(I)和 ETR(II)分別代表光系統I和II的電子傳遞速率, 反映了兩個光系統的活性。

由圖 2可知, 滸苔經細胞穿膜肽 R9和FITC-R9處理10 min后, 實驗組與對照組的Fv/Fm相比沒有太大差別(圖 2a); R9處理后的 ETR(I)有略微的下降, 但與對照組相比沒有顯著性差異;FITC-R9處理后的 ETR(I)有略微上升, 分析原因可能是由于熒光素在 Dual-PAM 測量過程中被激發顯示出熒光, 該部分光被藻體吸收后, 增強了光系統 I的電子傳遞速率。ETR(II)則一直保持恒定, 無論是 R9處理還是 FITC-R9處理, ETR(II)的值都沒有變化(圖2b)。

為了驗明較長處理時間后細胞穿膜肽是否對大型海藻光合作用有影響, 作者在3 h后對已用R9以及FITC-R9處理后的滸苔再次進行光合效率測量。實驗結果如圖 2c以及圖 2d所示, 實驗組和對照組的Fv/Fm值基本保持一致, ETR(I)和 ETR(II)也都相對恒定。這說明一定濃度的R9對滸苔的光合作用效率基本沒有負面影響。

圖1 熒光標記的九聚精氨酸轉導大型海藻細胞Fig.1 Translocations of fluorescent labeled nona-arginine on macroalgaea. 紫菜葉狀體; b. 海帶雌配子體; c. 海帶雄配子體; d. 紫菜絲狀體; e. 滸苔; f. 海帶孢子體

圖2 滸苔經細胞穿膜肽R9以及FITC-R9導入后光合效率的變化Fig.2 Changes in photosynthetic efficiency of U. prolifera after being treated with R9 and FITC-R9a. 處理后10 min滸苔的Fv/Fm變化; b. 處理后10 min滸苔ETR(I)和ETR(II)的變化; c. 處理后3 h滸苔的Fv/Fm變化; d. 處理后3 h滸苔ETR(I)和 ETR(II)的變化

如圖3a所示, 經由R9和FITC-R9處理10 min后的紫菜Fv/Fm與對照組相比沒有顯著性變化, 有略微的上升。ETR(I)同樣有略微上升的趨勢, 而ETR(II)則保持恒定(圖3b)。3 h后重新測量的結果表明, R9處理的紫菜Fv/Fm與對照組相比仍然是略微偏高, 而FITC-R9處理的紫菜與對照組相比則略有下降的趨勢, 可能是由于3 h后熒光素已發生部分淬滅。除此之外, 無論是 R9處理還是 FITC-R9處理, 與對照組相比, ETR(I)和ETR(II)基本上都沒有發生變化。

圖3 細胞穿膜肽R9以及FITC-R9導入紫菜后的光合作用效率變化Fig.3 Changes of photosynthetic efficiency of P. yezoensis after being treated with R9 and FITC-R9a. 處理后10 min 紫菜的Fv/Fm變化; b. 處理后10 min紫菜ETR(I)和ETR(II)的變化; c. 處理后3 h紫菜的Fv/Fm變化; d. 處理后3 h紫菜ETR(I)和ETR(II)的變化

海帶的結果基本上與滸苔和紫菜保持一致(圖4),無論是處理10 min還是3 h, 與對照組相比, R9處理以及FITC-R9處理后海帶的Fv/Fm都沒有下降(圖4a,圖4c), ETR(I)和ETR(II)的值也沒有受到太大影響。不過, 與處理10 min的相比, 海帶的ETR(I)和ETR(II)在3 h后整體有顯著下降, 這可能是因為海帶本身的抗逆性較弱, 時間較長后其本身的光合作用活性就會有下降, 而不是由于CPPs引發的光系統活性降低。因此, 與對照組相比, 實驗組的 ETR(I)和 ETR(II)仍沒有顯著性變化。

總的來說, 細胞穿膜肽 R9不會對這三種大型海藻產生脅迫效應, 經R9處理后的Fv/Fm不會下降。同時, R9對其光系統的活性也不會有負面影響。這間接證明了細胞穿膜肽R9對大型海藻沒有毒害作用。

3 討論

細胞穿膜肽具有極強的穿透能力, 目前該特性已被廣泛的應用在醫學領域(Polyakovet al, 2000;Rothbardet al, 2000; Wadiaet al, 2005)。有些人為設計的 CPPs甚至可以穿透滲透性極低的血腦屏障, 從而將藥物輸送到特殊的靶位點(Costantinoet al,2005)。對于高等植物或者藻類, CPPs則需要穿過細胞壁和細胞膜這兩層屏障。因此, CPPs的穿膜效率與藻體細胞壁的結構有密切的關系, 細胞壁越厚, 對于CPPs的阻礙效果越強。比如說, 與絲狀體相比, 紫菜的葉狀體的細胞壁更薄。作者的實驗結果也表明紫菜葉狀體相對于絲狀體能夠攝入更多的CPPs。另外, 海帶的雌配子體比雄配子體的 CPPs轉導效率要高, 可能說明雌配子體細胞壁的滲透性比雄配子體要大。由此看來, 細胞穿膜肽有助于研究比較大型海藻不同世代的細胞壁的結構, 主要著重于研究其滲透性。

圖4 細胞穿膜肽R9以及FITC-R9導入海帶后的光合作用效率變化Fig.4 Changes of photosynthetic efficiency of L. japonica after being treated with R9 and FITC-R9a. 處理后10 min海帶的Fv/Fm變化; b. 處理后10 min海帶ETR(I)和ETR(II)的變化; c. 處理后3 h海帶的Fv/Fm變化; d. 處理后3 h海帶ETR(I)和ETR(II)的變化

已有的研究表明, CPPs對動物細胞和植物細胞基本上無毒性(Vivèset al, 1997; Unnamalaiet al, 2004;Changet al, 2005)。本文作者測量了CPPs處理后大型海藻的光合作用效率的變化, Dual-PAM 的結果表明CPPs對大型海藻的光合作用效率沒有負面影響, 也就是說 CPPs對大型海藻基本無毒性, 從而能夠安全高效的應用于大型海藻的研究。后續的研究可以利用CPPs攜帶各類生物小分子或大分子進入大型海藻,將原本無法滲透進入藻細胞的物質轉導進入大型海藻, 發揮其生物學功能。

目前關于 CPPs的轉導機制仍存爭議, 然而現有研究表明無論是動物細胞還是高等植物細胞, CPPs都能夠適用, 具有普適性。CPPs在藻類特別是大型海藻方面的研究較為匱乏, 其介導外源物質轉導進入大型海藻的特性, 將來應該有更為廣闊的應用前景。

Atherton E, Sheppard R C, 1989. Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach. Oxford, England New York: IRL Press at Oxford University Press

Chang M, Chou J-C, Lee H-J, 2005. Cellular internalization of fluorescent proteins via arginine-rich intracellular delivery peptide in plant cells. Plant & Cell Physiology, 46(3):482—488

Chugh A, Amundsen E, Eudes F, 2009. Translocation of cell-penetrating peptides and delivery of their cargoes in triticale microspores. Plant Cell Reports, 28(5): 801—810

Costantino L, Gandolfi F, Tosi Get al, 2005. Peptide-derivatized biodegradable nanoparticles able to cross the blood-brain barrier. Journal of Controlled Release, 108(1): 84—96

Crombez L, Aldrian-Herrada G, Konate Ket al, 2008. A new potent secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery into mammalian cells. Molecular Therapy,17(1): 95—103

Frankel A D, Pabo C O, 1988. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 55(6):1189—1193

Gupta B, Levchenko T S, Torchilin V P, 2005. Intracellular delivery of large molecules and small particles by cell-penetrating proteins and peptides. Advanced Drug Delivery Reviews 57(4): 637—651

Hyman J M, Geihe E I, Trantow B Met al, 2012. A molecular method for the delivery of small molecules and proteins across the cell wall of algae using molecular transporters.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109(33): 13225—13230

Lindgren M, H?llbrink M, Prochiantz Aet al, 2000.Cell-penetrating peptides. Trends in Pharmacological Sciences, 21(3): 99—103

Liu B R, Chou J-C, Lee H-J, 2008. Cell membrane diversity in noncovalent protein transduction. Journal of Membrane Biology, 222(1): 1—15

M?e M, Myrberg H, Jiang Yet al, 2005. Internalisation of cell-penetrating peptides into tobacco protoplasts.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,1669(2): 101—107

Maxwell K, Johnson G N, 2000. Chlorophyll fluorescence——a practical guide. Journal of Experimental Botany, 51(345):659—668

Park C B, Yi K -S, Matsuzaki Ket al, 2000. Structure–activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: the proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(15): 8245—8250

Polyakov V, Sharma V, Dahlheimer J Let al, 2000. Novel Tat-peptide chelates for direct transduction of technetium-99m and rhenium into human cells for imaging and radiotherapy. Bioconjugate Chemistry, 11(6): 762—771

Popper Z A, Michel G, Hervé Cet al, 2011. Evolution and diversity of plant cell walls: from algae to flowering plants.Annual Review of Plant Biology, 62: 567—590

Rothbard J B, Garlington S, Lin Qet al, 2000. Conjugation of arginine oligomers to cyclosporin A facilitates topical delivery and inhibition of inflammation. Nature Medicine,6(11): 1253—1257

Suresh A, Kim Y-C, 2013. Translocation of Cell Penetrating Peptides onChlamydomonas reinhardtii. Biotechnology and Bioengineering, 110(10): 2795—2801

Turner J J, Ivanova G D, Verbeure Bet al, 2005. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.Nucleic Acids Research, 33(21): 6837—6849

Unnamalai N, Kang B G, Lee W S, 2004. Cationic oligopeptide-mediated delivery of dsRNA for post-transcriptional gene silencing in plant cells. FEBS Letters, 566(1—3): 307—310

Vivès E, Brodin P, Lebleu B, 1997. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. Journal of Biological Chemistry, 272(25): 16010—16017

Wadia J S, Dowdy S F, 2005. Transmembrane delivery of protein and peptide drugs by TAT-mediated transduction in the treatment of cancer. Advanced Drug Delivery Reviews,57(4): 579—596