肌肉特異表達microRNA的功能研究

石 軍 褚武英 張建社

(長沙學院生物與環境科學系, 長沙 410003)

綜述

肌肉特異表達microRNA的功能研究

石 軍 褚武英 張建社

(長沙學院生物與環境科學系, 長沙 410003)

MicroRNA 作為非編碼小 RNA分子在轉錄和后轉錄水平調控基因表達過程中扮演重要角色, 已成為當前分子生物學的研究熱點之一。近期已有研究證實, 一些在肌肉細胞中特異表達microRNA包括miR-1、miR-206和 miR-133可能對肌肉生長和發育很關鍵。眾所周知, 肌肉不僅是機體重要結構組織和運動器官,而且還是水產畜牧產品的重要蛋白源。聚焦這些肌肉特異myomiRs在肌肉生長和發育中的功能機理研究, 不僅有助于揭示某些疾病的分子機制和解決醫學上基因治療難題; 同時也為畜牧水產養殖提供科學應用理論依據。綜述我們概括了miR-1, miR-206和miR-133 最新研究進展, 這將有助于深入了解其作用于肌肉生長和發育的功能和分子機制。

肌肉干細胞(肌衛星細胞); 生長與發育; 基因調控; microRNA

MicroRNAs (miRNAs) 作為內源非編碼小RNA分子(–22 bp)與特定基因mRNA的3′ UTR 模板序列互補退火, 從而在轉錄后水平上抑制靶基因mRNA的翻譯或促使 mRNA的降解[1]。在人基因組中含有相當于轉錄因子的 miRNAs多達上千種[2]。單個的 miRNA能夠有多個靶 mRNA, 并且單個mRNA可以成為多個 miRNA靶目標, 這使得調控潛在基因的表達更加復雜多樣。在大多情況下, miRNA微調基因表達, 但是也是某些基因表達的開關, 參與發育、新陳代謝和免疫反應等多種生物過程。許多病理現象都與 miRNAs的錯誤表達相關,如癌癥、心血管病、心肌梗塞等[3—6]。因此, miRNA的研究成為近年來的生命科學研究熱點之一。

Bernstein等[7]通過敲除小鼠 Dicer基因研究了miRNA在發育過程中整體功能。眾所周知, Dicer是miRNA的前體(pre-miRNA)加工形成成熟 miRNA (mature miRNA) 這一過程關鍵的蛋白, 敲除 Dicer能阻斷功能性成熟miRNA分子的形成。實驗發現胚胎7.5d出現致命性后果, 原腸胚形成期發育停止[7]。 O’Rourke 等[8]、Chen等[9]以及Zhao等[10]采用組織特異的 Dicer 缺失的方法揭示 miRNA是使骨骼肌和心肌準確形態發生所必需的。盡管這些實驗有力地證明了miRNAs在組織和器官發育和生長中不可缺少, 但是并沒有闡明單個 miRNA生物功能和作用機理。

肌肉細胞發育開始于中胚層干細胞響應胞外信號而形成成熟的肌肉細胞或成肌細胞。雖然目前的研究已經能夠初步解釋參與肌肉細胞增殖分化信號傳導過程, 但是這個復雜過程中很多機制還不太清楚。最近的研究表明, 一種在脊椎動物中高度保守的新的RNA小分子參與肌肉細胞增殖、分化、收縮和應激反應等過程, 這種小分子就是肌肉特異的miRNAs[5]。miRNAs 在所有類型細胞都有發現, 而有一些只在特定的組織內表達。在肌肉組織中存在著特異表達的 miRNAs被稱為肌肉 microRNA (myomirs), 如: miR-1、miR-133、miR-206 和miR-208等。這些myomirs可以劃分為不同的家族,主要為miR-1家族和miR-133家族。miR-1家族由miR-1 和 miR-206兩個亞家族組成; 從低等動物線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophila)到高等脊椎動物機體內都能發現進化高度保守的miR-1家族成員的表達。miR-206亞家族目前只發現一個成員, 只在骨骼肌表達, 而不在心肌表達。在線蟲和果蠅基因組中只含有單獨的 miR-1基因, 而在魚類、雞(Gallus gallus)、老鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的基因組中 miR-1亞家族含有兩個相似的轉錄本miR-1-1 和 miR-1-2。盡管他們由不同的基因編碼, 但是成熟態的 miR-1序列卻完全一致。miR-133家族由miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b 和 miR-133c 等組成, 他們序列高度相似。miR-208作為心肌特異表達的 microRNA逐漸為人所知, 它由α-MHC 的一個內含子編碼。其他的如miR-128、miR-302、miR-367 和 miR-499可能是潛在的心肌特異的 miRNAs, 但他們的功能還有待進一步研究證實[6]。有意思的是這些肌肉特異的miR-133、 miR-1 和miR-206在基因組上呈雙順反子對(Bicistronic pairs)排列。在家鼠中, miR-1-1 和miR-133a-2基因簇位于2號染色體上, miR-1-2 和miR-133a-1基因簇位于18號染色體上, miR-206 和miR-133b基因簇則位于1號染色體上[11]; 與之對應, 人類miR-1/133/206基因簇分別位于20、18和6號染色體上; 雞則位于20、2 和3號染色體上; 斑馬魚(Danio rerio)位于23、18、20號染色體上。值得一提的是斑馬魚miR-206-2 和miR-133c共同位于17號染色體上構成額外的雙順反子對。雖然這些miR-1 與miR-133 基因簇上位置高度保守, 但是他們種子序列(Seed sequence)不同, 他們功能也各異[11, 12]。

1 Myomirs的調控

在骨骼生肌細胞和心肌組織胚胎發育及肌肉分化過程中主要有三種肌肉特異的 microRNA 表達,分別為miR-1、miR-206 和 miR-133, 他們受肌肉調節因子(Muscle regulatory factors, MRFs)調控。Sweetman等[12]通過成纖維細胞源生長因子(Fibroblast growth factor, FGF) 抑制小鼠C2C12肌肉細胞的分化, 從而干擾 MRF的活性, 導致 miR-1、miR-206 和 miR-133的表達受到抑制。此外, 在小鼠和雞胚胎實驗中, 過表達MRFs可誘導miR-1 和 miR-206表達異常, 同時還發現當敲除Myf5, 導致miR-1和miR-206表達缺失[12]。血清效應因子(Serum response factor, SRF), 肌細胞增強子 2 (Myocyte- enhancer factor 2, Mef2) 和MyoD 作為主要的肌原分化調節因子, 體外和體內實驗證實他們是 miR-1-1和miR-1-2起始所必需的。SRF能夠結合和激活起始區域, 在小鼠實驗中發現敲除 SRF會導致內源的miR-1-1和 miR-1-2的表達缺失[13]。盡管早先還沒有成功敲除小鼠 miR-1基因的報道, 但通過過表達miR-1會導致肌細胞過早分化和增殖缺陷最終導致發育受阻、心室肌壁薄化和心力衰竭等癥狀[13]。在體外培養的細胞實驗中發現, miR-1通過靶作用于肌肉分化的壓制者組蛋白去乙?；?4 (Histone deacetylase 4, HDAC4), 從而促使肌肉生成[14]。HDAC4同樣很可能是成骨細胞分化和骨骼基因形成過程中miR-140的靶基因[15]。這表明在細胞分化過程中, 同一個基因可成為兩個或多個不同的 miRNA的靶基因。此外, miR-1、miR-133和miR-206 反而抑制自身的調節因子SRF和 HDAC4等的表達, 形成一個負調控回路[14, 16]。這一負調控回路機制有助于解釋miR-1/206 與miR-133的鮮明差異。過表達miR-1首先抑制HDAC4, 隨后抑制MEF2, 增加肌管分化[14]。與此相反, miR-133抑制SRF的表達, 從而增加成肌細胞增殖, 這一調控回路機制或許是胚胎發育過程中肌肉細胞增殖與分化的特異調控通路[14]。

類似的結果在心肌中研究也有發現, Kwon等[17]和Sokol 等[18]發現抑制果蠅miR-1會導致部分心肌細胞不分化, 而缺失會導致未分化的肌原細胞大量積累; 與此相反, 過表達miR-1擾亂胚胎心肌結構。有意思的是, 敲除果蠅 miR-1并不影響幼蟲肌肉組織的形成和生理機能, 但是在飼養和生長過程中會出現大量肌肉畸形和死亡個體。因此推斷某些microRNA并非組織分型所必需的, 但是對隨后組織的增長和維持不可缺少[18]。在小鼠中也有相似結果, 過表達 miR-1, 導致心室細胞減少, 抑制了Hand2的表達, 致使心力衰竭[14]。缺失miR-1-2, 導致小鼠心臟腫大, 這表明 miR-1-2 負調控心肌增殖。在爪蟾( Xenopus laevis)中研究發現, 胚胎注射miR-1后會導致心肌發育不正常并且減少心肌細胞增殖; 當注射miR-133, 則發現心臟高度紊亂, 不能形成心室和心環, 細胞增殖明顯提高[14]。另有多項實驗證實, miR-133a是心肌增殖和心臟發育不可缺少的關鍵因子, 并研發現心肌傳導障礙與 miR-1和miR-133的異常表達有直接關系[10, 19, 20]。

2 Myomirs參與肌衛星細胞增殖與分化

脊椎動物肌肉生長分為限定(Determinate)和非限定(Indeterminate)兩種生長模式。肌肉限定生長最典型的代表動物就是哺乳類, 因為其個體大小是有限的; 而魚類肌肉生長相對來說是非限定的, 因為魚類并沒有固定的大小, 而有些魚類在整個生命中都在持續生長[21]。這兩種生長模式最主要的區別在于肌纖維(Muscle fiber) 的生長差異。與哺乳類不同的是, 魚類之所以表現為非限定生長主要是因為魚類可以通過補充新的肌纖維 (即為 Hyperplasia)來增加肌肉量, 同樣也可以增加已有的肌纖維的大小(即為 Hypertrophy)[22, 23]。魚類孵化后期的肌細胞增殖也即為肌肉的補充過程使得魚類肌肉生長模式與其他脊椎動物不同, 主要是因為魚類出生后肌纖維數量不是固定的, 而隨后伴隨著的是肌肉纖維的增粗和肥大過程[24]。魚類肌細胞來源于肌肉干細胞(Satellite cells), 它是提供肌肉生長和修復過程中新肌纖維的細胞來源。 由于該類細胞具有自我分化和更新的能力, 因而也被稱之為肌肉干細胞[25]。肌衛星細胞一旦被激活就分化形成肌衛星細胞驅使的成肌細胞, 并且進一步增生, 分化和融合形成肌管,隨后成熟的肌管形成肌纖維。已有的研究表明, Pax3 和Pax7 的表達是肌衛星細胞的特異性標志。同時,他們在肌衛星細胞增殖和分化中發揮重要作用[26]。當 Pax7 基因敲除引起肌衛星細胞凋亡, 繼而導致動物出生后個體瘦小, 甚至幾乎沒有肌肉再生[27, 28]。Pax3 和 Pax7 作為轉錄因子直接調節生肌調節因子Myf5和MyoD 的表達, 繼而影響肌細胞分化。通過基因表達和細胞定位研究揭示, 肌衛星細胞通過非對稱性細胞分裂來維持生肌細胞的激活和自我更新, 即一部分來自肌衛星分裂的子細胞維持著干細胞功能, 而另一些子細胞則被激活形成肌細胞進而發育成肌纖維[29—31]。這類維持干細胞特性的子細胞持續保持Pax3和Pax7的高量表達, 而已激活進入分化肌細胞階段的子細胞則高量表達Myf5 和MyoD。因此, Pax3/Pax7和Myf5/MyoD表達量的改變是控制肌衛星細胞增殖和激活分化的關鍵轉點[31, 32]。Chen 等[33]發現, 肌衛星細胞分化時 miR-1 和 miR-206顯著上調表達, 肌肉損傷時明顯下調。實驗進一步確認, miR-1 和 miR-206促使肌衛星細胞分化是通過直接抑制靶基因Pax7而發揮作用。體內實驗證實, 抑制 miR-1 和 miR-206提高肌衛星的增殖并且增加了 Pax7的蛋白水平。與此相反, 過表達miR-1和miR-206 顯性失活突變體(Dominant negative mutant)能夠維持 Pax7的表達, 最終抑制成肌細胞的分化[33]。

3 Myomirs的靶基因

骨骼肌細胞發育源于胚胎中胚層, 成肌細胞增殖或最終分化成肌管都依賴此重要階段。McCarthy 等[34, 35]發現, 小鼠錯誤表達 miR-206 和 miR-133a會導致肌肉營養失調(Dystrophy)[34, 35]。獲得或丟失miRNA靶位點可能會導致一些基因表達失調而產生疾病。Alex 等[36]發現在名為Texel 的羊myostatin基因3′UTR上一位點G突變為A后, 恰好暴露成為mir-1 和 mir-206的靶位點, 從而使得myostatin表達受到抑制, 最終導致Texel羊的肌肉粗大, 異常肥胖。miRNA 之所以能夠抑制靶基因的表達依賴于mRNA 的3′UTR的識別位點與miRNA的種子序列相匹配的關鍵的 7個堿基長度的核苷酸, 但是有時這還遠不足以有效, 還需要其他的額外的特征才能有效抑制 mRNA的表達。Andrew 等[37]總結出識別序列有效性的 5個廣譜特性: 即識別位點附近富含AU核苷酸、附近存在可識別多個miRNA(有利于 miRNA協同作用)位點、與 miRNA 配對需要13—16長度的核苷酸殘基、距離mRNA 3′UTR 終止位點至少 15 bp長度以及 3′UTR 序列偏長的mRNA的識別序列位點距離中間部位也相應偏遠。鑒于miRNAs 序列的保守性, 為靶基因的預測和鑒定提供了可行性。盡管如此, 但真正已確認的靶基因數量仍然有限。目前在哺乳動物中, miRNA-1和miRNA-133已鑒定出與肌肉細胞增殖和增粗相關的靶基因分別為Cdk9、Rheb、RASA1、Calmodulin、MEF2A和SRF等; 而cyclinD2、Rho-A、Cdc42、WHSC2、Fstl1、Pola1和Utrn被鑒定為骨骼肌特異表達的 miRNA-206的靶基因[11]。Yuichiro 等[38]在模式生物斑馬魚中鑒定出一批miRNA-1和133的靶基因, 如 actr3、arpc4I、arpc5a、arpc5b、bactin1、bactin2、cnn2、cnn3a、cnn3b、coro1c、dctn5、parva、pdlim1、pfn2、pfn2I和TPM3等, 研究表明這些潛在靶基因可能與肌小節(Sarcomere)肌動蛋白(Actin)的組裝相關, 但是并沒有后續報道。Yin 等[39]通過過表達的方法在斑馬魚中鑒定出mir-133的靶基因,如mps1、cdc37、PA2G4、cx43和cldn5等, 并證實mir-133限制損傷誘導的心肌細胞(Cardiomyocyte)的增殖。在癌癥研究方面, 也鑒定出myomirs 的靶基因, 如mir133a通過靶基因 Bcl-xL 和Mcl-1能夠抑制骨肉瘤癌細胞增殖而促使細胞凋亡[40]; mir133a 還直接作用于靶基因FSCN1而扮演胰腺癌腫瘤壓制者的角色[41]。Mataki等[42]發現下調表達Mir-1/133a 功能基因簇增強肺鱗狀上皮癌細胞的遷移和入侵, 當恢復正常表達 Mir-1/133a后, 通過錨定靶基因冠蛋白 1C (Coronin-1C)抑制癌細胞的增殖、遷移和入侵。Yin 等[43]發現mir-133a 通過靶作用于Prdm16 調控骨骼肌衛星細胞褐色脂肪的分型(Brown adipose determination), 這一研究發現使得mir-133成為治療糖尿病重要藥物作用靶點。在研究糖尿病性心肌病病例時發現下調mir-1的表達, 會增加氧化應激, 導致糖尿病性心肌功能紊亂, 而接頭蛋白(Junction)成為mir-1的靶蛋白[44]。

4 Myomirs研究展望

至目前, 有關myomirs 的研究僅僅局限于過表達和報告基因活性檢測來確定靶基因這兩種主要研究手段, 而有效的基因敲除技術手段的運用必將極大地提升對myomirs的系統研究。目前在哺乳動物和魚類等脊椎動物中成功敲除 miRNAs 已有少量報道。在小鼠中, 敲除 miRNAs后有較為明顯的表型(Phenotype) 的有mir-155、mir-17-92、mir-144、mir-143/145、mir-145、mir-451、mir-140、mir-150、mir-223、mir-375和mir-126等, 而單獨敲除mir-106、mir-143以及mir-182并沒有明顯的表型; 與此相似,單獨敲除mir-208a、mir-208b、mir-499、mir-133a-1、mir-133a-2以及 mir-206也未見明顯的表型[45—50]。有意思的是, 單獨敲除 mir-1-2 則導致心肌缺陷,大約 50%胚胎致死, 這暗示 mir-1的功能性單倍劑量不足(Haploinsufficiency)。這一結果表明, mir-1在心肌發育過程中的重要性, 而雙敲除mir-1-1和mir-1-2基因成為必須, 將進一步揭示心肌發育機理[51]。Srivastava[51, 52]實驗室繼敲除小鼠 mir-1-2后, Heidersbach 等[ 52]敲除小鼠mir-1-1。他們發現 mir-1-1突變小鼠呈現與mir-1-2缺失突變體相似的表型。雜合的(Compound) mir-1突變體小鼠在斷奶前無規律地死亡歸因于嚴重的心肌功能障礙(Dysfunction);與此同時 mir-1-null 小鼠肌小節不正常組裝并且下調肌球蛋白輕鏈2 (Myosin light chain-2, MLC2)的磷酸化; 細胞骨架調節因子(Cytoskeletal regulator) Telokin作為平滑肌限制的(Muscle-restricted)MLC2磷酸化的抑制子與其他平滑肌基因在心肌中異常表達; mir-1壓制 Telokin 通過直接靶作用于 Telokin的轉錄調控者 myocardin, 抑制 myocardin的轉錄,這些實驗證明 mir-1是心臟發育所必需的, 而且是通過調控平滑肌基因表達網絡轉錄和效應的節點來加強條紋肌肉(Striated muscle)的顯型[52]。在哺乳動物中, 許多miRNAs 存在基因雙拷貝或高度相似性,使得功能富余和互補。單敲除 mir-133a-1和 mir-133a-2 未見任何明顯的表型; 而同時敲除導致胚胎發育延遲和 50%新生小鼠心室中膈缺損(Ventricular septal defect)和心腔擴張(Cardiac chamber dilation)而死亡[48]。最新研究表明, 心肌胚胎發育依賴 miR-1-1/ 133a-2和 miR-1-2/133a-1基因簇的協調運作, 雙敲除這兩個基因簇壓制轉錄共同激活子心肌素蛋白(Myocrdin)的表達, 而 myocardin是平滑肌(Smooth muscle, SM)基因表達的主要的調控者[53]; DAN芯片實驗證實, 敲除mir-1/133a簇導致Kcnmb1、Bmp10、transgelin、myocardin和Acta2等基因顯著上調, 而先前推定的 mir-1/133a的靶基因 Hand2、SRF、IRX5、Ccnd2、Kcnd2和Hdac4的表達與對照野生型相比并無明顯差異。由此可見, 先前體外實驗熒光素酶活性檢測預測靶基因的方法的準確性可見一斑,而體內實驗基因敲除成為研究基因功能的首選。Zhang等[54]和 Miller 等[55]在Nature biotechnology雜志同期報道了從黃單胞菌(Xanthomonas sp.)中分離和鑒定出一種能對基因有效修改和編輯的蛋白名為類轉錄激活效應核酶(Transcription activator-like effectors nucleases, TALEN), 其原理主要是通過TAL effector DNA 結合區域和FokI 切割區域兩個融合蛋白有效破壞內源靶基因。隨后 TALEN技術相繼被廣泛運用于哺乳類, 兩棲類爪蟾的組織細胞和胚胎基因敲除實驗[56—60]; 而在斑馬魚中 TALEN技術已越發成熟[61—64]。此外, 一種從釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)中分離出的核酸內切酶Cas蛋白利用 CRISPR/Cas9 系統也能對目的基因在基因組準確位點進行有效切割, 此方法有效率高達30%以上[65—68]。目前此兩種高效的基因敲除技術紛紛被用于模式生物斑馬魚基因敲除實驗, 生命科學從而進入全新的基因敲除時代[69, 70], 相信 myomirs的功能將會得到進一步闡釋。當前我們承擔魚類miRNA-1/133a在肌肉發育與生長中的功能研究課題, 通過最新基因敲除技術建立突變模型, 試圖解釋魚類mir-1/133a基因簇的協同作用機制。當前斑馬魚中已有miRNAs敲除的成功報道, Xiao 等[71]采用CRISPR/Cas9和TALEN系統成功敲除mir-126a/b 和1號, 9號染色體miRNAs基因簇, 這將為miRNA功能研究提供重要參考價值和技術支撐。

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THE FUNCTIONAL STUDIES OF MUSCLE-SPECIFIC MICRORNAS

SHI Jun, CHU Wu-Ying and ZHANG Jian-She
(Department of Biological and Environmental Science, University of Changsha, Changsha 410003, China)

MicroRNAs are small non-coding RNA molecules that play important roles in the transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression. MicroRNAs have become one of the hotspot issues in molecular biology. Recently several microRNAs have been identified including miR-1, miR-206 and miR-133 that are specifically expressed in muscle cells and may be crucially involved in the development and growth of muscles. Muscles are an important part of body structure as well as a locomotive organ, and they are also the main protein source in aquaculture and animal husbandry. Therefore, functional studies of the roles of muscle-specific microRNAs will help uncover the mechanisms of certain diseases, facilitate medical gene therapy, and provide guidance for the animal husbandry and fishery. In this review we summarized the latest research on miR-1, miR-206 and miR-133 that shed lights on better understanding of their functions in muscle development and growth.

Muscle stem cells (satellite cell); Growth and development; Gene regulation; microRNA

Q344

A

1000-3207(2015)06-1224-07

10.7541/2015.159

2014-12-10;

2015-03-11

國家自然科學基金(No. 31402271; 31230076)資助

石軍(1983—), 男, 湖北黃岡人; 博士; 主要從事魚類基因調控研究? E-mail: Junshi@ccsu.edu.cn, Junshistone@gmail.com

張建社, 男, 湖南長沙人; 教授; 主要從事魚類肌肉發育與基因調控研究。E-mail: jzhang@ccsu.cn