乙炔基雌二醇(EE2)對雄性黃顙魚GtH 3個亞基基因表達的影響

譚 號 李英文 饒劍軍 劉智皓

(重慶師范大學生命科學學院, 重慶市高校生物活性物質工程研究中心, 重慶市高校動物生物學重點實驗室, 重慶 401331)

乙炔基雌二醇(EE2)對雄性黃顙魚GtH 3個亞基基因表達的影響

譚 號 李英文 饒劍軍 劉智皓

(重慶師范大學生命科學學院, 重慶市高校生物活性物質工程研究中心, 重慶市高校動物生物學重點實驗室, 重慶 401331)

為研究乙炔基雌二醇(EE2)是否能影響雄性黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)垂體中促性腺激素 3個亞基基因的表達, 從而干擾 FSH和 LH的分泌, 研究采用末端快速擴增(RACE)的方法在黃顙魚垂體中克隆了促性腺激素的2個β亞基(FSHβ和LHβ)的全長cDNA, 對其組織表達模式和雌雄性垂體中的季節表達模式進行了研究; 另外, 研究還用100 ng/L的EE2對雄性黃顙魚(2齡)進行了28d的暴露處理。結果發現, 黃顙魚FSHβ cDNA全長528 bp, ORF為399 bp, 編碼132個氨基酸; LHβ全長為870 bp, ORF為417 bp, 編碼138個氨基酸。序列分析結果表明, 黃顙魚FSHβ含有一個17氨基酸的信號肽, 2個保守的N-糖基化位點和13個半胱氨酸殘基, 而LHβ含有一個18個氨基酸的信號肽, 1個N-糖基化位點和12個半胱氨酸殘基, 與其他鯰形目魚類極其相似。進化分析顯示, 黃顙魚FSHβ和LHβ與鯰形目的魚類進化關系較近。組織分布結果發現, 黃顙魚3亞基均僅在垂體中表達。季節表達模式結果表明, 雌雄黃顙魚GtHα和LHβ表達水平在5月份左右達到最高, 隨后降低; FSHβ在雌性的表達模式與GtHα和LHβ相同, 而在雄性, FSHβ的表達沒有明顯變化。半定量RT-PCR結果顯示, 100 ng/L的EE2能顯著抑制黃顙魚促性腺激素3個亞基基因的表達。研究認為, EE2抑制黃顙魚雄性垂體FSH和LH的分泌, 可能阻礙其正常的精子發生、精子成熟和排精過程, 從而影響其正常的繁殖和發育。

黃顙魚; 促性腺激素β亞基; cDNA克隆; 基因表達; 乙炔基雌二醇

內分泌干擾物(EDC, Endocrine Disrupting Chemicals)能模擬動物內源激素的生理生化功能, 改變動物體 內源激素的合成、代謝或與激素受體的結合,從而干擾動物內分泌系統[1]。更多的研究表明, EDC不僅對高等動物影響巨大[2], 對低等脊椎動物(包括魚類)同樣危害極大。EDC暴露的魚類會發生性腺發育異常、生殖能力下降、配子發生障礙等[3, 4]。因此, 對 EDC影響魚類性腺發育和配子發生及其可能的分子機制逐漸成為魚類生理學和生態毒理學研究的熱點。

魚類的性腺發育和配子發生不僅受到性腺局部因子的調節, 還受到垂體細胞合成與分泌的糖蛋白激素——促性腺激素(Gonadotropin hormone, GtH)的調節, 其功能包括促進生殖細胞(配子)的生長、發育、成熟、排精及排卵等[5]。在哺乳動物中促性腺激素有 2種: 促卵泡刺激素(Follicular stimulating hormone, FSH)和促黃體生成素(Luteinizing hormone, LH)。魚類也有2種促性腺激素, 即GtHⅠ和GtHⅡ,分別對應于哺乳動物的FSH和LH[6]。這2種激素由相同的α亞基分別與不同的β亞基(FSHβ或LHβ)組成[7, 8]。盡管下丘腦-垂體-性腺軸對魚類內分泌系統至關重要[9], 但相關研究集中在EDC對魚類性腺發育的影響, 關于EDC對魚類垂體的影響研究較少。

乙炔基雌二醇(EE2, 17α-ethynylestradiol), 是長江污染水體中的典型 EDC 之一[10], 濃度可達2.67 ng/L[11, 12]。由于EE2分布廣泛且具有強烈的雌激素效應(比雌二醇(E2, 17β-estradiol)高1—5倍[13, 14]),能嚴重影響魚類雄性的精巢發育和精子功能, 甚至導致精巢畸變和繁殖障礙[15—19]。黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)俗稱黃臘丁, 屬鯰形目(Siluriformes), 鲿科(Bagridae), 黃顙魚屬(Pelteobagrus), 是長江流域重要的養殖魚類和捕撈對象。已有研究表明, EE2能嚴重影響黃顙魚雄性幼魚的精巢發育和精子發生[20], 但EE2是否能影響雄性黃顙魚垂體中促性腺激素的分泌, 進而造成精巢發育和精子發生障礙, 尚不得而知。

本研究在黃顙魚垂體中克隆了促性腺激素2個β亞基(FSHβ和 LHβ)的全長 cDNA(GtHα已克隆),對其組織表達模式和季節表達模式進行了研究。同時, 本研究用100 ng/L的EE2對雄性黃顙魚(2齡)進行了28d的暴露處理, 并用半定量PCR的方法檢測了EE2對促性腺激素3個亞基基因(GtHα、FSHβ 和LHβ)mRNA水平的影響, 以探討EE2對垂體中促性腺激素分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

實驗所用黃顙魚雌雄性成魚購自重慶盤溪水產市場。解剖雌雄黃顙魚成魚各組織(T. 精巢、O. 卵巢、H. 心臟、S. 脾臟、HK. 頭腎、K. 腎臟、I. 腸、P. 垂體、B. 腦、M. 肌肉、L. 肝臟), 迅速放入液氮中速凍, –80℃保存備用。

1.2 總RNA提取和第一鏈cDNA的合成

根據 Trizol(Invitrogen)說明書, 從黃顙魚成魚提取垂體總RNA, 并測定其濃度。取1 μg總RNA, 經 gDNA Eraser(TaKaRa)去除基因組 DNA后, 按PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)說明書合成第一鏈cDNA。

1.3 引物設計

根據 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公布的斑點叉尾(Ietalurus punetaus)、革胡子鯰(Clarias gariepinus)、南方鯰(Silurus meridionalis)等FSHβ和LHβ的cDNA序列, 在其保守區域設計引物, 其中黃顙魚GtHα序列號: ACX37700(本實驗所用引物見表1、序列號見表2)。

1.4 FSHβ和LHβ亞基cDNA的克隆

利用已合成的第一鏈 cDNA在 PCR擴增儀(Bio-Rad IQ5)上擴增中間片段。擴增條件為: 94 ℃3min, 35個循環的94 30s℃ , 52 30s℃ , 72 30s℃ , 延伸7min。擴增片段在1% 的瓊脂糖凝膠上電泳, 溴化乙錠(EB)染色后, 在凝膠成像系統上分析。目的片段用膠回收試劑盒(Geneview)純化后亞克隆入pMD19-T載體(TaKaRa), 隨后用 CaCl2法轉化到大腸桿菌DH5α, 經藍白斑篩選后, 將陽性克隆送上海英駿公司(Invitrogen)測序。

根據測序驗證后的中間片段序列設計RACE引物, 擴增黃顙魚FSHβ和LHβ cDNA的5′和3′末端,步驟參照SMARTTMRACE cDNA Amplification kit (Clontech)說明書進行。根據測序得到 5′序列和 3′序列進行拼接, 并進行End-to-End PCR擴增驗證。引物見表1。

表1 引物序列Tab. 1 The primer sequences

1.5 FSHβ和LHβ亞基序列的同源性分析

根據已獲得的FSHβ和LHβ全長 cDNA序列,應用DNAStar 和Clustal X 軟件推導其氨基酸序列并進行多重序列對比分析。用Mega5.0軟件構建系統進化樹, 進化樹中的數值表示隨機進行1000次計算的重復率, 代表該進化樹的可靠性。除澳洲鰻鱺(Anguilla australis)部分氨基酸序列由 EST推導外,其他物種FSHβ和LHβ氨基酸序列均從GenBank下載。序列號見表2。

1.6 黃顙魚GtH 3個亞基的組織表達模式

根據 Trizol(Invitrogen)說明書, 用–80℃保存備用的各組織提取總RNA。取1 μg總RNA, 用gDNA Eraser (TaKaRa)去除基因組 DNA后, 合成第一鏈cDNA。用基因特異性引物(GtHα-F/R、FSHβ-F1/R1 和LHβ-F1/R1)研究3個亞基基因在黃顙魚各組織中的表達模式, 并以β-actin (β-actin F/R) (252 bp)作為內參。含質粒和蒸餾水為模板擴增的產物分別作為陽性和陰性對照。擴增條件為: 為94 3min℃ , 25(目的基因)和 20(β-actin)個循環的 94 30s℃ , 55℃和52 30s℃ , 72 30s℃ , 延伸7min。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳, EB染色后在凝膠成像系統上進行拍照、分析。

1.7 季節表達模式的研究

在2013年的2、5、8、9和 12月分別收集黃顙魚雌雄成魚各6尾, 作為6個平行樣, 取其垂體,液氮速凍后, –80℃保存備用。PCR擴增檢測方法見1.6。數據用 6尾魚的平均值±標準誤(Mean±SE)表示。結果用SPSS 13.0 (Chicago, USA)進行方差分析和差異比較, P＜0.05, 差異顯著。柱形圖用GraphPad Prism 5(San Diego, CA)進行繪制。

1.8 雄性黃顙魚的EE2暴露處理

2014年 10月, 于重慶盤溪水產市場購得雄性黃顙魚(2齡)50尾, 選取體長[(15.20—17.80) cm]和體重[(62.20—70.51) g]相當的黃顙魚共36尾。飼養水溫(24±1)℃, 自然光周期, 每天喂食2次。馴養2周后, 將上述實驗魚隨機分為 6組: 3個對照組(C, 0.05‰ DMSO)和3個EE2(100 ng/L)處理組, 每組6尾。在暴露處理的 7d、14d和 28d取材, 每組取 2尾魚的垂體組織, 液氮速凍后, –80℃保存備用。實驗方法和數據處理見方法1.7。

2 結果

2.1 FSHβ和LHβ克隆結果

采用RT-PCR和RACE的方法克隆得到黃顙魚FSHβ (KP036408)和LHβ (KP036409)全長cDNA序列,其中 FSHβ長 528 bp, 包含 5′非編碼區(Untranslated region, UTR)6 bp, 3′UTR 123 bp, ORF為399 bp, 編碼132個氨基酸; LHβ長870 bp, 包含5′UTR 105 bp, 3′UTR 348 bp, ORF為417 bp, 編碼138個氨基酸。

表2 物種及其序列號Tab. 2 The species and the corresponding accession numbers

2.2 序列及系統進化分析

、革胡子鯰和南方鯰的氨基酸序列高度保守。黃顙魚FSHβ和LHβ分別有2個和1個糖基化位點,同時含有13個和12個半胱氨酸殘基位點, 與其他鯰形目魚類高度保守, 同時還發現, 黃顙魚FSHβ和LHβ各自含有17和18個氨基酸組成的信號肽。

系統進化分析結果表明, 魚類和四足類 FSHβ 和LHβ均明顯分為兩支。其中, 黃顙魚FSHβ和LHβ在魚類中與同為鯰形目的斑點叉尾、革胡子鯰、南方鯰的進化距離最近, 其次與鯉形目的斑馬魚較近, 與其他物種魚類較遠, 而與四足類最遠(圖1)。

圖1 黃顙魚與其他脊椎動物FSHβ(A)和LHβ(B)的系統進化樹Fig. 1 The phylogenetic tree based on the sequences of FSHβ (A) and LHβ (B) of yellow catfish and other vertebrates

2.3 組織表達模式

組織表達模式的研究結果表明, 黃顙魚促性腺激素三個亞基GtHα、FSHβ和LHβ僅在雌雄垂體中表達, 而在性腺等其他組織中沒有表達(圖2)。

2.4 季節表達模式

季節表達模式的研究結果表明, 黃顙魚雌魚GtHα、FSHβ和LHβ表達水平均在2到5月份達到最高, 而在8月、9月和12月不同程度上顯著性下調(圖3A、B、C)。與雌性的結果相似, 雄魚GtHα、FSHβ和 LHβ表達水平在 2到 5月份也達到最高, GtHα和 LHβ表達水平開始呈上調趨勢, 隨后顯著抑制(圖3D、F); 不同的是, FSHβ的表達水平表現出逐月下調的變化趨勢(圖3E), 但差異不顯著。

2.5 EE2對基因表達的影響

半定量RT-PCR結果顯示, EE2在處理28d顯著抑制黃顙魚促性腺激素3個亞基的表達。在處理后7d, GtHα和LHβ的表達呈上升趨勢, 且LHβ的表達顯著上調; 處理14d后, GtHα和LHβ的表達和處理組和7d相比呈下調趨勢, 其中LHβ的表達顯著下調(圖4A、C); 不同的是, EE2處理后7d, FSHβ的表達量沒有變化, 處理后 14d, 表達量開始顯著下調(圖4B)。

圖2 GtHα、FSHβ和LHβ在黃顙魚各組織中的表達Fig. 2 The tissue-specific expression of GtHα, FSHβ and LHβ in Pelteobagrus fulvidraco

圖3 GtHα(A、D)、FSHβ(B、E)和LHβ(C、F)在雌雄黃顙魚垂體中的季節表達模式Fig. 3 The seasonal pattern of expression of GtHα (A, D), FSHβ (B, E) and LHβ (C, F) in the pituitary of Pelteobagrus fulvidraco

圖4 EE2對黃顙魚雄性幼魚垂體GtHα(A)、FSHβ(B)和LHβ(C)表達的影響Fig. 4 The effects of EE2 on the expression of GtHα (A), FSHβ (B)和LHβ (C) mRNA in male Pelteobagrus fulvidraco

3 討論

3.1 FSHβ和LHβ序列分析

本研究利用RT-PCR和RACE的方法從黃顙魚垂體中擴增出了FSHβ和LHβ cDNA全長序列。推導的氨基酸多重序列分析發現, FSHβ和LHβ與同為鯰形目的斑點叉尾同源性最高, 其次革胡子鯰和南方鯰。黃顙魚FSHβ成熟肽序列中含有2個N-糖基化位點, 13個保守的Cys和17個氨基酸組合成的信號肽, 而LHβ成熟肽含有1個N-糖基化位點, 12個保守的Cys和18個氨基酸組合成的信號肽。眾所周知, 蛋白質的一級結構決定高級結構, 高級結構則決定蛋白質的功能, 而N-糖基化位點和Cys殘基為FSHβ和LHβ蛋白折疊、特異性受體結合等功能所必需[21]。黃顙魚FSHβ和LHβ保守的N-糖基化位點和Cys殘基數量充分說明FSHβ和LHβ的結構和功能可能在魚類進化中具有高度保守性, 與南方鯰的研究相似[22]。系統進化分析結果表明, 黃顙魚的FSHβ和LHβ分別與鯰形目魚類的FSHβ和LHβ聚為一小分支, 二者與硬骨魚的魚類聚為一大分支,與四足類再聚為一分支, 按照其分類地位嚴格聚類。

3.2 FSHβ和LHβ mRNA組織表達分析

組織表達模式的結果表明, GtHα、FSHβ和LHβ僅在垂體中表達, 而在其他已研究的組織中不表達,表明垂體是黃顙魚FSH和LH是主要分泌器官。不同的是, 在南方鯰中, GtH 3個亞基不僅在垂體中表達, 還在卵巢中表達, 其中FSHβ在雌性南方鯰腸中也有微弱表達[22]。更有趣的是, 斑馬魚、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)和條石鯛(oplegnathidae fasciatus)的 FSHβ和 LHβ不僅垂體和卵巢中表達,在腦和肝等組織也有微弱表達[23—25], 表明GtH 3個亞基基因的組織表達模式具有顯著的物種差異性。

3.3 季節表達模式的分析

有研究表明, 黃顙魚為周年產卵性魚類, 其繁殖季節主要集中在每年的5—7月, 此時黃顙魚排卵和排精最為旺盛[26, 27]。在雌性中, FSH主要參與卵母細胞分化、發育和卵黃的積累, 而LH則參與卵母細胞的成熟與排卵, 因而魚類FSH分泌量的峰值要早于 LH[9]。本研究的結果顯示, 黃顙魚雌性垂體LHβ表達的峰值出現在5月份, 略早于其繁殖季節; 而FSHβ的峰值出現在2月份左右, 早于LHβ的峰值, 與周年產卵性魚類雌性卵母細胞發育的特點密切相關[28]。而在雄性, FSH主要參與精子發生和減數分裂, LH則主要參與精子的成熟和排精[9]。本研究的結果表明, 黃顙魚雄性垂體LHβ的峰值也出現在5月, 與其在雌性的峰值出現時間完全相同。LHβ的表達在魚類雌雄性同時出現峰值[26, 27], 為保證雌雄魚能在相對固定的時間同時形成成熟的配子, 成功進行繁殖至關重要。然而, 與雌性FSHβ的峰值出現在2月份不同, 雄性FSHβ的表達相對穩定, 沒有明顯的季節差異。與之相對應的是, 黃顙魚雄性比雌性多一次繁殖高峰[26, 27], 表明黃顙魚雄性可能具有長時間持續產生精子的潛力, 暗示FSH在雄性的水平可能常年處于較高水平, 與本研究的結果一致。黃顙魚雄性的繁殖高峰多于雌性, 很可能是黃顙魚一種特殊的繁殖策略。

3.4 EE2對FSH和LH分泌的影響

黃顙魚是我國長江流域重要的養殖對象和捕撈品種, 經濟效益巨大。但近年來的研究表明, 長江流域逐漸成為EDC污染的重災區, 且呈日趨惡化的態勢, 嚴重威脅長江經濟魚類正常的生長和繁殖[11]。其中, EE2作為一種典型的內分泌干擾物, 能嚴重影響魚類雄性的精巢發育和精子發生[29]。然而, 國內外學術界對EE2影響長江經濟魚類的報道很少。前期研究表明, EE2能導致黃顙魚雄性幼魚精子發生障礙, 出現生殖細胞凋亡甚至部分性反轉的現象[20],但其影響是僅局限于精巢, 抑或作用于整個下丘腦—垂體—性腺軸, 有待進一步研究。本研究用EE2對雄性黃顙魚進行了暴露處理, 結果顯示, 處理 28d 后, EE2顯著抑制黃顙魚促性腺激素 3個亞基的表達。不同的是, EE2始終抑制 FSHβ的表達, 而對GtHα和LHβ的影響為先上升, 再下降?？紤]到FSH 和LH各自的不同功能, 推測EE2首先抑制黃顙魚精子發生的開始階段, 然后抑制精子的成熟、排精等最后過程。與本研究結果類似, EE2能抑制稀有鯽(Gobiocypris rarus)和銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)FSHβ和LHβ的表達[30, 31], 造成魚類精巢發育和生殖障礙[32]。因此, 本研究認為, EE2對魚類精巢發育和精子發生的影響, 不僅局限于精巢本身,還可能影響內分泌的高級中樞——垂體。綜上所述, EE2可能通過抑制促性腺激素GtH 3個亞基基因的表達, 干擾黃顙魚精子發生和成熟, 影響黃顙魚正常的精巢發育和繁殖, 給我國長江流域經濟魚類的水產養殖帶來潛在風險。

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THE EXPRESSION OF THREE GONADOTROPIN SUBUNITS IN RESPONSE TO 17α-ETHYNYLESTRADIOL IN MALE PELTEOBAGRUS FULVIDRACO

TAN Hao, LI Ying-Wen, RAO Jan-Jun and LIU Zhi-Hao
(Chongqing Engineering Research Center of Bioactive Substances, Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

In this paper, we investigated how 17α-Ethynylestradiol (EE2) regulated the expression of three gonadotropin subunits in male Pelteobagrus fulvidraco. We cloned the full-length cDNA sequences of two subunits of gonadotropin hormone (FSHβ and LHβ) from the pituitary of Pelteobagrus fulvidraco by using RACE. We explored the tissue-specific and the seasonal pattern of expression of the genes. Male Pelteobagrus fulvidraco (2 years old) were exposed to EE2 (100 ng/L) for 28 days. We found that the length of FSHβ cDNA sequence was 528 bp and it contained a 399-bp open reading frame (ORF) which encoded a precursor protein of 132 amino acids (aa). The length of LHβ cDNA sequence was 870 bp and it contained a 417 bp ORF that encoded a precursor protein of 138 aa. The sequence analysis showed that FSHβ had a predicted signal peptide of 17 aa, 2 N-glycosylation sites, and 13 cysteine residues. LHβ had a predicted signal peptide of 18 aa, 1 N-glycosylation site, and 12 cysteine residues. The phylogenetic analysis showed that FSHβ and LHβ were closely related to other Siluriformes species. The tissue expression analysis suggested that all the gonadotropin subunits were expressed specifically in pituitary. The seasonal pattern of expression in both genders was that GtHα and LHβ mRNA peaked in May and then decreased gradually, and the expression of FSHβ in female also peaked in May but the expression in male remained unchanged. We applied semi-quantitative RT-PCR and demonstrated that the expression of the three gonadotropin subunits was dramatically suppressed by EE2. We speculated that EE2 might reduce the generation of FSH and LH in the pituitary of male Pelteobagrus fulvidraco, which would probably inhibit spermatogenesis and the maturation of sperm and spermiation, and consequently impair the testicular development and reproduction.

Yellow catfish; Gonadotropin hormone β subunits; cDNA cloning; Gene expression; 17α-Ethynylestradiol

X174

A

1000-3207(2015)06-1117-09

10.7541/2015.147

2014-11-24;

2015-03-02

重慶市科委項目(cstc2012jjA20006); 重慶市教委項目(KJ130622); 重慶師范大學校級項目(12 xlb005)資助

譚號(1989—), 男, 湖北利川人; 碩士研究生; 主要從事魚類生殖生理和分子內分泌研究。E-mail: hardytam@163.com

劉智皓; E-mail: minenut@163.com