玉屏風散對魚類非特異性免疫和免疫相關基因表達的影響

張倩倩劉天強李彤彤徐 靜龍 夢王謝昊龔小寧李愛華

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 通威股份有限公司, 成都 610041)

玉屏風散對魚類非特異性免疫和免疫相關基因表達的影響

張倩倩1, 2劉天強3李彤彤1, 2徐 靜3龍 夢1, 2王謝昊1, 2龔小寧1李愛華1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 通威股份有限公司, 成都 610041)

為探究傳統中藥玉屏風散在水產養殖上的生物學功效, 在基礎飼料中分別添加2.5%、5%和10%的玉屏風散和1%的芪參散配成實驗飼料, 飼喂實驗魚2周, 然后分別觀察兩種中藥對羅非魚(體重約220 g)的生長、非特異性免疫及免疫相關基因表達的影響以及對草魚(體重約20 g)免疫保護率的影響。結果顯示: 各中藥組均提高了羅非魚增重率, 10%玉屏風散組效果最顯著; 各實驗組中羅非魚肝、腎、脾體指數和各血液學指標與對照組無顯著差異; 各中藥組羅非魚谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)含量均不高于空白對照組; 2.5%、10%玉屏風散組和1%芪參散組堿性磷酸酶(AKP)含量均高于對照組(P＞0.05); 各藥物組羅非魚溶菌酶活性均高于對照組, 且2.5%玉屏風散組與對照組差異顯著(P＜0.05); 玉屏風散各劑量組羅非魚呼吸暴發活性均高于對照組(P＞0.05); 羅非魚肝臟中熱休克蛋白70 (HSP70)在各實驗組中表達量均上調, 腎臟中HSP70在2.5%和 5%玉屏風散組表達量上調, 脾臟中 HSP70在各實驗組中表達量均下調; 肝臟中轉化生長因子受體TGFRⅢ在 2.5%玉屏風散組表達量上調, 腎臟中 TGFRⅢ在 2.5%玉屏風散組和 1%芪參散組表達量上調, 脾臟中 TGFRⅢ在各實驗組中表達量均上調; 玉屏風散各劑量組能夠提高草魚對嗜水氣單胞菌的抵抗能力, 表現為死亡率降低和進入血液的細菌減少, 其中 5%玉屏風散組效果最佳。實驗表明, 玉屏風散能夠有效促進羅非魚生長, 對其非特異性免疫指標以及免疫相關基因表達均有不同程度的促進作用, 并能夠有效地提高草魚的免疫保護率。

羅非魚; 草魚; 玉屏風散; 芪參散; 生理生化指標; 非特異性免疫; 免疫基因; 免疫保護率

隨著我國魚類養殖業的不斷擴大, 高密度、集約化的養殖模式導致病害的頻繁發生與流行, 近年來病毒性疾病、細菌性疾病、寄生蟲病造成魚類養殖業的巨大損失。傳統的化學藥物和抗生素在治療魚病過程中會造成環境污染、病原生物耐藥性增強和組織藥物殘留等問題, 嚴重威脅人類的健康和安全。中藥添加劑具有成本低、副作用小、使用安全、應用范圍廣的特點, 可以直接添加到飼料中, 不僅可以抑殺病原微生物, 還可以增強魚體免疫系統,提高魚體的抗應激能力和防御機能, 從而達到預防疾病的目的。近年來中藥添加劑廣泛應用于水產養殖, 符合健康無公害水產品生產的要求, 在魚病防治上具有廣闊的應用前景。

中藥復方玉屏風散由黃芪、白術、防風組成[1],有補脾實衛、益氣、固表、止汗的功效[2], 在我國已有近 700年的歷史。關于玉屏風散在小鼠(Mus musculus)[3]、雛雞(Gus gallus)[4]、人類(Homo sapiens)鼻炎[5]上的應用已有報道, 但在水產動物養殖中應用的報道卻不多。為此, 本研究預以玉屏風散為中藥飼料添加劑, 研究投喂含不同劑量中藥的飼料對羅非魚非特異性免疫指標及免疫相關基因表達的影響, 為玉屏風散在水產養殖中的應用提供理論依據。芪參散主要成分是黃芪、人參、甘草, 具有扶正固本的功效, 用于增強水產動物的免疫功能, 提高抗應激能力。芪參散是首批轉正的國標漁藥。在此實驗中, 用芪參散為陽性對照, 以此來探究傳統方劑玉屏風散的生物學功效。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚及飼養條件 實驗用魚來自湖北省武漢市江夏湯遜湖某養殖場, 體質健壯, 無病無傷,選取規格相近的魚體為實驗對象, 羅非魚平均體重為(220±20) g, 草魚平均體重為(18±2) g。養殖水缸體積約為 200 L, 以充分曝氣除氯的自來水作為循環水源, 全天24h充氧。實驗魚暫養2周適應環境后進行實驗。每天投喂2次(09:00和17:00), 日總投喂量為魚體重的2%, 每天吸污換水1次, 實驗期間水溫維持在28℃左右。

實驗藥物 玉屏風散的配方為: 防風 1份,黃芪2份(蜜炙), 白術2份, 粉碎至60目, 由四川通威股份有限公司提供。

實驗飼料 實驗組中向基礎飼料中分別添加2.5%、5%和 10%的玉屏風散以及 1%的芪參散, 對照組為基礎飼料, 用小型顆粒機制成顆粒狀飼料, 在55℃烘箱中烘干后于4℃密封保存?；A飼料購自武漢九州神農藥業有限公司, 配方及各成分含量為粗蛋白質 30%、粗纖維 12%、粗灰分 15%、鈣0.40%—2.50%、總磷 0.7%、食鹽 0.30%—1.20%、水分12.5%、總賴氨酸1.2%。

1.2 實驗方法

實驗設計 實驗分4個實驗組和一個對照組,每組12尾, 實驗組分別投喂含2.5%、5%和10%的玉屏風散以及 1%的芪參散, 折合成每千克體重日投喂0.5、1.0、2.0 g和0.2 g相應的藥物, 分別設為A1、A2、A3和 A4組; 對照組投喂基礎飼料設為 A0組。飼養15d后進行羅非魚相關免疫指標的測定。

樣品的采集 每組隨機取5尾魚, 80 mg/L的MS 222麻醉后, 尾靜脈采血, 將每尾魚所采的血液分2份, 其中一份于采血管中4℃保存; 另一份分裝于 2 mL無菌 Ep管中, 室溫放置 1h后, 4 , ℃3500 r/min離心20min, 取血清。采血管及部分血清送往湖北省武漢大學中南醫院測定血液學及血清學生化指標。分離頭腎、肝臟、脾臟, 稱重, 計算臟器指數。另取 5尾魚取其腎臟、肝臟、脾臟于 Trizol 中, –80℃保存; 取頭腎, 分離頭腎細胞。

臟器指數[6]將分離的頭腎、肝臟、脾臟分別稱重, 計算臟器指數。頭腎體指數(%)=MHK/MT× 100%; 肝臟體指數(%)=ML/MT×100%; 脾體指數(%)=MS/MT×100%, 式中: MT為實驗結束時魚體重(g); MHK為頭腎重量(g); ML為肝臟重量(g); MS為脾臟重量(g)。

血液學指標 取全血樣品和血清樣品送湖北省武漢大學中南醫院檢測, 全血樣品用美國雅培Ruby全自動血球分析儀進行白細胞計數、紅細胞計數、紅細胞壓積、血紅蛋白含量及淋巴細胞百分比,血清樣品用美國貝克曼AU5400全自動生化分析儀檢測總蛋白、白蛋白、血糖、尿素氮、堿性磷酸酶、總膽固醇、丙氨酸轉氨酶及谷草轉氨酶活性。

血清溶菌酶活性[7]用磷酸鈉緩沖液(0.05 mol/L pH 6.2)將溶壁微球菌(Sigma)配成0.3 mg/mL的菌液, 分別向96孔板中加入10 μL的測試血清后, 加入 250 μL菌液, 快速混勻后, 25℃下490 nm波長測定0.5min和4.5min后的吸光值,以一分鐘內吸光值下降0.001為一個活性單位U。

呼吸暴發[8]分離頭腎組織, 用L-15培養液(含2%胎牛血清, 10 μ/mL肝素(sigma)和100 μg/mL青鏈霉素)清洗組織兩次后, 過0.2 μm濾篩。細胞懸液平鋪到事先準備好的 34%/51% Percoll梯度分離液上, 4 , 400℃ ×g, 離心40min。收集34%和51%分離液之間的細胞, 用L-15培養液4 , 400℃ ×g, 離心10min清洗兩遍, 用L-15培養液(含0.1%胎牛血清, 100 μg/mL青鏈霉素)調節細胞濃度為2×106cells/mL, 28℃細胞培養箱培養。

細胞懸液 28℃培養 2h后, 移除培養液, 用HBSS清洗掉未貼壁細胞, 每孔加入 100 μL 含Zymson A(1 mg/mL)和NBT(1 mg/mL)的HBSS, 28℃培養1h后移除液體, 用甲醇固定10min后, 分別用100%、70%、70%的甲醇清洗各孔, 室溫風干, 每孔加120 μL KOH和140 μL DMSO, 充分混勻后于630 nm處測吸光值。

免疫相關基因表達[9]將儲存在–80℃的組織取出解凍后, 于研缽中用液氮研磨, 用 Trizol (Invitrogen)試劑提取頭腎、肝臟、脾臟組織中的總RNA, 用超微量紫外分光光度計進行 RNA純度測定, 并用無RNase活性的DNase去除基因組DNA。逆轉錄酶(Takara)將 RNA反轉錄成 cDNA, 合成反應終體積為20 μL, 于–20℃保存備用。

采用 Primer Premier 5.0軟件進行 Real-time PCR中的引物(表1)設計, 引物設計所依據的基因模板序列均來自于NCBI DNA數據庫, 各基因NCBI登錄號分別為 β-actin (KJ 126772)、Hsp70 (XM 005466767)、TGFRⅢ (XM 005451165)。Real-time PCR反應采用熒光染料SYBR Green, 在Bio-Rad熒光定量PCR儀上進行, 以β-actin為內參基因。在總體積為25 μL的反應液體中, 含有2 μL cDNA模板, 1 μL正反向引物(引物濃度為 10 μm/L), 12.5 μL SYBR Mix以及8.5 μLddH2O。反應條件如下: 95℃變性30s; 95 ℃ 5s, 60 ℃ 30s, 40個循環。最終免疫基因的表達量用 2–ΔΔCt的方法進行分析, 其中ΔΔCt= (Ct,目標基因–Ct, β-actin)實驗組–(Ct,目標基因–Ct, β-actin)對照組。

1.3 攻毒實驗

為探究投喂玉屏風散對魚體細菌感染的保護效果, 用草魚作為實驗對象, 用分別含 2.5%、5%和10%和 0%玉屏風散(A1、A2、A3、A0)的餌料投喂兩周, 在結束投喂的第 2天進行攻毒實驗。同時另設一組, 一直投喂飼喂空白飼料, 但在攻毒前1天飼喂一次含 10%玉屏風散的餌料(記為B組)。將嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila DLNG101)接種于BHI固體培養基, 28℃培養16—18h, 用PBS緩沖液洗下菌苔, 離心去上清后用 PBS重懸浮, 調節細菌濃度為2×107cfu/mL。每尾魚腹腔注射0.2 mL菌液, 每組20尾, 水溫為23℃。注射后觀察并記錄各組死亡時間、數量。統計96h內各組的“尾×時”數(魚的尾數乘以存活的小時數), 并統計感染 7d內各組累積死亡率, 計算RPS, 并進行卡方檢驗分析。另外, 對即將死亡的草魚(記入死亡數)采集尾靜脈血, 分離細菌。

1.4 數據統計與分析

數據用SPSS 19統計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 用Duncan’s多重比較分析組間差異, 差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 玉屏風散對羅非魚臟器指數的影響

由表2可知, 對照組羅非魚增重率為0.39%, 實驗組魚體增重率明顯高于對照組。頭腎體指數除A3組外均低于對照組, 但差異不顯著(P＞0.05); 肝體指數A1組、A4組與A2組差異顯著(P＜0.05), 其他各組差異不顯著(P＞0.05); 脾體指數A4組明顯高于其他各組, 且差異顯著(P＜0.05)。

表1 Real time PCR引物Tab. 1 Primers used in real time PCR

表2 玉屏風散對羅非魚臟器指數的影響Tab. 2 The effects of Jade screen powder on the viscera index of Tilapia

2.2 玉屏風散對羅非魚血液學指標的影響

由表3可知, 羅非魚全血中的白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積和淋巴細胞百分比實驗組與對照組均差異不顯著(P＞0.05)。在羅非魚血清各指標影響中, 各組實驗組中總蛋白和血糖含量差異不顯著(P＞0.05), A1、A4組丙氨酸轉氨酶和谷草轉氨酶含量明顯低于A2、A3和A0組, 且差異顯著(P＜0.05), A4、A0組白蛋白含量差異顯著(P＜0.05), 而 A1、A2、A3組差異不顯著(P＞0.05), A1組堿性磷酸酶水平與A2差異顯著(P＜0.05), 與其他各組差異不顯著(P＞0.05), 而A2組與A1、A3、A4差異顯著(P＜0.05), 與A0差異不顯著(P＞0.05), A2、A4組血清總膽固醇含量差異顯著(P＜0.05), 其他各組不顯著(P＞0.05)。

2.3 玉屏風散對羅非魚血清溶菌酶活性的影響結果顯示(圖1): 實驗組血清溶菌酶活性均高于對照組, 其中 A1組溶菌酶活性與對照組差異顯著(P＜0.05), 其溶菌酶活力高低次序為A1組、A4組、A3組、A2組、A0組。

表3 玉屏風散對羅非魚血液學指標的影響Tab. 3 The effects of Jade screen powder on hematological indexes of Tilapia

圖1 玉屏風散對羅非魚血清溶菌酶活性的影響Fig. 1 The effects of Jade screen powder on the activity of lysozyme in Tilapia

2.4 玉屏風散對羅非魚淋巴細胞呼吸暴發的影響

結果顯示(圖2): A1組、A2組、A3組呼吸暴發強度均高于A0組, 但差異不顯著(P＞0.05); A4組呼吸暴發強度低于對照組, 但差異也不顯著(P＞0.05)。

圖2 玉屏風散對羅非魚淋巴細胞呼吸暴發的影響Fig. 2 The effects of Jade screen powder on the respiratory burst activity in Tilapia

2.5 玉屏風散對羅非魚免疫基因(Hsp 70和TGFRⅢ)表達量的影響

結果顯示(圖3): 肝臟中各組Hsp70表達均上調, 且A1、A2與A3組差異顯著(P＜0.05), A3組達到最高, 是對照組的17.52倍, 腎臟中A1和A2組Hsp70表達上調, A3和 A4組下調但差異不顯著(P＞0.05),脾臟中各組Hsp 70表達量均下調; 肝臟中A1、A2組與A3、A4組差異顯著(P＜0.05), 且A1組TGFRⅢ表達量上調, 為對照組的1.42倍, 腎臟中除A3組下調, 其他各組表達均上調, 但各組間差異不顯著(P＞0.05), 脾臟中各組 TGFRⅢ表達量均上調, 但差異不顯著(P＞0.05)。

2.6 玉屏風散對草魚免疫保護率的影響

圖3 玉屏風散對羅非魚肝臟、腎臟、脾臟中Hsp70和TGFRⅢ基因表達的影響Fig. 3 The effects of Jade screen powder on the expression of Hsp 70 and TGFRⅢ relative to β-actin in the liver, the kidney, and the spleen of tilapia

表4 攻毒后魚體的死亡時間與死亡數量Tab. 4 The number and time of death after infection

實驗魚在注射嗜水氣單胞菌后, 不同時間的死亡情況見表4。在注射攻毒28h后, A0組有5尾死亡, A1組1尾、A2組0尾、A3組3尾、B組2尾死亡; 90h后, A0組有11尾死亡, A1組4尾、A2組0尾、A3組6尾、B組6尾死亡, 計算各組實驗魚在注射攻毒后所有魚的累計存活時間, 則 A1組為181、A2組為0、A3組為210、A0組為507、B組為 337; 玉屏風散各濃度組的保護率分別為 A1組63%、A2組為100%、A3組為45%、B組為45%。從 2.5%玉屏風散組和對照組即將死亡的草魚尾靜脈血中分離出細菌且對照組菌落數明顯多于 2.5%玉屏風散組, 其他各組血液中未分離出細菌。這也說明了兩種中藥都有促進機體殺滅細菌的作用。

3 討論

本研究選用經典方劑玉屏風散和芪參散作為實驗魚飼料添加劑, 通過對組織相關物質含量、酶活性、呼吸暴發等指標及HSP70和TGFRⅢ基因的表達量分析, 研究中藥添加劑對羅非魚生理生化指標、非特異性免疫及免疫相關基因表達的影響, 通過攻毒實驗研究中藥添加劑對草魚免疫保護率的影響, 以期較全面的分析中藥添加劑對魚類生長及免疫方面的作用和效果。

3.1 玉屏風散對羅非魚生長指數的影響

近年來, 中草藥在水產養殖領域的應用受到廣泛關注。研究表明, 中草藥對水產動物的生長性能有明顯促進作用。如劉愛君等[10]在奧尼羅非魚飼料中添加 0.50%甘露寡糖使稚魚、魚種的增重率分別提高 13.7%和 18.4%; 劉興國等[11]在羅非魚的飼料中分別添加 0.25%、0.50%、1.00%和 2.00%的殼聚糖, 發現殼聚糖顯著降低了羅非魚的飼料系數, 添加量以 0.50%最為適宜。本實驗用含不同劑量玉屏風散和芪參散的飼料飼喂羅非魚 2周后, 實驗組魚體體重增加率明顯高于對照組, 且魚體體重增加率隨著玉屏風散劑量的增加而增加, 10%玉屏風散組促進效果最佳, 說明玉屏風散和芪參散均對羅非魚的生長具有良好的促進作用, 而最適的添加劑劑量還需要進一步探討; 各組的頭腎、肝臟、脾臟指數差異不明顯。

3.2 玉屏風散對羅非魚血液生理生化指標的影響

血細胞在魚類疾病防御過程中發揮重要作用,是免疫能力和疾病診斷[12]的指標之一。血紅蛋白是魚類非特異性免疫的一項指標, 可以在一定程度上反映魚類健康狀況, 高含量的血紅蛋白是魚體健康的表征[13]。實驗結果顯示, 中藥組血紅蛋白含量雖與對照組雖無顯著差異, 但均高于對照組, 說明玉屏風散和芪參散均可在一定程度上促進羅非魚的健康。血清中的AST、ALT作為反映魚類肝功能的重要指標[14], 同時也可以反映體內蛋白質的代謝情況[15, 16]。ALT和AST在轉氨酶中作用最強, 在機體蛋白質代謝中起著重要作用。5%、10%玉屏風散組和對照組AST、ALT含量無顯著差異, 2.5%玉屏風散組和芪參散組還甚至低于對照組。魚體新陳代謝部分是由物質的磷酸化和去磷酸化調節的, AKP是魚體生長代謝、維持內環境穩態所必需的酶。除5%玉屏風散組外, 其他各實驗組雖與對照組差異不顯著, 但 AKP含量均高于對照組, 說明 2.5%、10%玉屏風散和芪參散均可提高羅非魚體內AKP活性。實驗組與對照組中白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積和淋巴細胞百分比均差異不顯著, 且均在健康范圍之內[17]。

3.3 玉屏風散對羅非魚血清溶菌酶的影響

作為魚類免疫的第一道防線, 血清溶菌酶阻止細菌的附著和定植, 是魚類重要的防御因子。溶菌酶是一種裂解酶, 可以水解細菌細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的B-1,4糖苷鍵, 導致細胞壁破裂, 主要作用于革蘭氏陽性菌[18]。吳英瑞等[19]發現用含 0.1%苦參的飼料飼喂羅非魚 20d后,能顯著提高血清溶菌酶活性; László Ardó等[20]發現黃芪和金銀花可以顯著提高羅非魚血清溶菌酶活性。本實驗結果顯示, 實驗組血清溶菌酶活性均高于對照組, 且 2.5%玉屏風散組與對照組差異顯著,說明玉屏風散和芪參散均可以促進羅非魚血清溶菌酶活性, 且玉屏風散添加量在2.5%時促進作用最明顯。

3.4 玉屏風散對羅非魚細胞呼吸暴發活性的影響

在吞噬細胞吞噬入侵異源物質的過程中會產生大量的呼吸暴發, 魚類吞噬細胞在呼吸暴發過程中會產生氧自由基, 產生的 O2–對魚類病原微生物毒性不大, 但其所產生的H2O2有很強的毒性[21]。超氧化物陰離子是呼吸暴發過程中的第一產物, 因此產生的氧負離子的量成為精確測定呼吸暴發的指標。Vera-Jimenez NI等[22]發現β-谷氨酸可以促進草魚頭腎細胞的呼吸暴發活性; Yin等[23]發現, 用含 0.5%靈芝多糖飼喂鯉(Cyprinidae)1周后能顯著提高鯉頭腎巨噬細胞的呼吸暴發活性。本實驗結果顯示, 除芪參散組外, 玉屏風散各實驗組呼吸暴發強度均高于對照組, 說明玉屏風散可有效促進羅非魚淋巴細胞的呼吸暴發強度, 提高魚類免疫力, 其中以5%添加量效果最佳。

3.5 玉屏風散對羅非魚免疫相關基因HSP70和TGF-β表達量的影響

HSP70是一種保守蛋白, 在正常情況下, HSP70在細胞內呈基礎表達, 表達水平較低, 而在各種應激因素如溫度陡變、病原菌感染或組織損傷時, 其表達量明顯上升[24]。HSP70在先天性免疫和獲得性免疫中發揮重要作用, 有研究指出中藥可以提高團頭魴(Megalobrama amblycephala)[25]和白對蝦(Penaeus orientalis)[26]的 HSP70的表達量。本實驗結果顯示,各實驗組均能提高肝臟中HSP70的表達量, 尤其是10%玉屏風散組和芪參散組, 提高倍數分別為17.52 和9.18; 在腎臟中, 2.5%、5%玉屏風散組HSP70表達量上調, 10%玉屏風散組和芪參散組表達量下調;在脾臟中各組基因表達量均明顯下調。

TGF-β是一種多功能的細胞因子, 在細胞生長和分化、組織修復和凋亡中起到重要作用[27]。TβR是一種細胞膜表面受體, TGF-β要發揮生物學作用必須與其受體結合, TGF-βR的改變是TGF-β發生功能變化的關鍵。最新發現TβR存在TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ三種形式, TβRⅢ是一種蛋白聚糖, 起到信號放大的作用[28], 是TGF-β發揮生物學作用所不可或缺的。實驗結果顯示, 肝臟中 TGFRⅢ的表達量除2.5%玉屏風散組小幅度上調外, 其他各實驗組表達量均下調, 腎臟中除 10%玉屏風散組小幅下調外,其他各實驗組均上調, 脾臟中各實驗組 TGFRⅢ表達量均小幅上調。

3.6 玉屏風散對草魚免疫保護率的影響

攻毒實驗結果顯示, 用含不同劑量玉屏風散和芪參散的飼料飼喂草魚兩周后, 實驗組魚體死亡率明顯低于對照組, 飼喂兩周含玉屏風散飼料后的草魚對嗜水氣單胞菌的抵抗能力顯著增強, 其中 5%玉屏風散組效果最佳, 飼喂 10%玉屏風散一次組嗜水氣單胞菌感染率低于對照組, 說明短時服用玉屏風散對魚體抵抗細菌感染也有一定的促進作用; 從保護率結果看, 5%玉屏風散組保護率最高為 100%, 2.5%玉屏分散組次之為 63%, 10%玉屏風散組為45%, 說明保護率與玉屏風散濃度并非呈正相關,濃度過高可能對魚體的肝臟有一定的損傷; 僅從2.5%玉屏風散組和對照組尾靜脈血液中分離出細菌且對照組細菌數明顯高于2.5%玉屏風散組, 說明高劑量的玉屏風散可以有效提高草魚的抵抗力, 防止細菌對魚體的感染。

綜上所述, 玉屏風散不同劑量實驗組對羅非魚體重增加率、生理生化指標、非特異性免疫及免疫相關基因的表達均有不同程度的增強和調節作用,也能有效地提高草魚免疫保護率, 說明玉屏風散作為飼料添加劑用于促進魚類生長、提高其免疫力方面具有一定應用價值。但這些作用與添加劑量密切相關, 而且各指標之間不存在一致性, 也就是說不存在一個可以使各種指標都呈現最理想變化的劑量。

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THE EFFECTS OF JADE SCREEN POWER ON THE NON-SPECIFIC IMMUNE RESPONSE AND THE EXPRESSION OF THE RELATED GENES IN FISH

ZHANG Qian-Qian1, 2, Liu Tian-Qiang3, Li Tong-Tong1,2, Xu Jing3, Long Meng1, 2,
Wang Xie-Hao1,2, Gong Xiao-Ning1and Li Ai-Hua1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China; 3.Tongwei Limited Company, Chengdu 610041, China)

In this study, we investigated the effects of Jade screen powder on the non-specific immune response and the expression of the related genes in tilapia (Oreochromis niloticus) as well as the effects on the resistance to the infection in grass carps. In order to explore the bio-activity of traditional Chinese herb Jade screen powder on aquaculture, the fish was fed with the four groups of diets supplemented with Chinese herbs (2.5%, 5%, 10% Jade screen powder and 1% Qishen powder) for 2 weeks. For tilapia, all four Chinese herb groups exhibited increase in the rate of the body weight gain, and 10% Jade screen powder had the most significant effect. There was no difference in the index of liver, kidney, spleen and in the haematological parameters between the treated groups and the control. Compared to the control group, the levels of AST and ALT were lower in the treated groups, but the level of AKP in the 2.5% and 10% Jade screen powder groups and 1% Qishen powder group was higher. There was an insignificant increase in the activity of the serum lysozyme in tilapia treated with jade screen powder at all three concentrations. Moreover, the activity of plasma lysozyme increased significantly in the group fed with 2.5% Jade screen powder compared to the control (P＜0.05). The herbal treatment also insignificantly elevated the production of ROS (reactive oxygen species) (P＞0.05). The expression of HSP70 was affected by the herbal treatments in a tissue-specific pattern: it was up-regulated in the liver, and in the kidney 2.5% and 5% Jade screen powder boosted the expression, however the expression was down-regulated in the spleen. The expression of TGFRⅢ was also differently regulated by the herbs in various organs: 2.5% Jade screen powder up-regulated the expression in the liver and the kidney, and 1% Qishen powder also had a stimulating effect in the kidney, and the expression could be enhanced by all treatments in spleen. Jade screen powder improved the resistance to the infection of Aeromonas hydrophila in grass carps, which was represented by the lower mortality rate and less bacteria in the blood, and 5% Jade screen powder was especially effective. These results suggested that Jade screen powder may improve the growth, the non-specific immune response and the expression of related genes in tilapia.

Tilapia; Grass Carp; Jade Screen Power; Qishen powder; Physiology and biochemical index; Non-specific immune response; Gene expression; Disease resistance

S965.1

A

1000-3207(2015)06-1076-09

10.7541/2015.142

2014-11-26;

2015-03-12

國家開放實驗室(FEBL)課題(2011FBZ26); 國家自然科學基金項目 (No. 31070112)資助

張倩倩(1989—), 女, 山東青島人; 碩士; 主要研究方向為中藥魚類免疫。E-mail: zhangqiantianyu623@163.com

李愛華, E-mail: liaihua@inb.ac.cn