人參莖葉提取物對刺參生長、免疫及抗病力的影響

郭 珺 俞 軍 陳永亮 楊先樂 胡 鯤 曹海鵬

(上海海洋大學, 上海 201306)

人參莖葉提取物對刺參生長、免疫及抗病力的影響

郭 珺 俞 軍 陳永亮 楊先樂 胡 鯤 曹海鵬

(上海海洋大學, 上海 201306)

以初始體重為(4.91±0.17) g的刺參(Apostichopus japonicas)為研究對象, 研究投喂不同劑量人參莖葉提取物對刺參生長、免疫及抗病力的影響, 探討人參莖葉提取物在刺參養殖中的應用。在每千克基礎飼料中分別添加10、20、40和80 g人參莖葉提取物作為實驗組, 并以基礎飼料為對照進行為期30d的飼喂養殖。結果顯示, 投喂人參莖葉提取物對刺參的生長并無顯著影響, 刺參特定生長率不隨人參莖葉提取物添加量的增加而提高。當人參莖葉提取物添加量為80 g/kg時, 刺參體腔細胞總數、呼吸暴發強度、細胞吞噬活性、超氧化物歧化酶活力、總一氧化氮合酶活力均顯著高于對照組(P＜0.05); 當人參莖葉提取物添加量為40 g/kg 時, 細胞吞噬活性也顯著高于對照組(P＜0.05), 但其余免疫指標與對照組相比無顯著差異(P＞0.05); 當人參莖葉提取物的添加量不大于20 g/kg時, 各項免疫指標與對照組之間均無顯著差異(P＞0.05)。攻毒實驗表明, 20、40和80 g/kg人參莖葉提取物組的健康率要高于對照組, 其中80 g/kg人參莖葉提取物組健康率為80.56%要顯著高于對照組和10 g/kg人參莖葉提取物組(P＜0.05)。人參莖葉提取物可作為免疫增強劑應用于刺參的養殖中來提高刺參的免疫和抗病能力。

刺參; 人參莖葉提取物; 生長; 免疫; 抗病

全世界約有1200多種海參[1], 而能夠為人類食用的大約40種。海參含有豐富的蛋白質, 較低的脂肪和糖含量[2], 同時還具有鈣、鎂、鐵、鋅、硒、錳等微量元素[3]?，F代醫學研究表明, 海參含有多種生物活性成分: 海參神經節苷脂具有協同神經生長因子(NGF)的作用從而誘發神經軸突生長[4], 從而為治療老年癡呆等神經退化病提供了可能; 從海參中分離得到的不同海參皂苷分別具有抑制腫瘤細胞生長、抗菌、調節機體免疫、促進骨髓紅細胞生長等作用[5—9]; 此外, 海參多糖有著抑制血管栓塞、治療慢性肝炎等特殊功效[10, 11]。在我國, 人們常說的海參通常指北方環渤海域的刺參(Apostichopus japonicas), 是所有海參中品質最好的。

我國刺參養殖業在20世紀90年代得到快速發展, 各種病害問題也日益嚴重, 其中以腐皮綜合癥(又稱皮膚潰爛病、化皮病)危害最大, 造成了重大的經濟損失, 嚴重制約刺參產業的持續健康發展[12]。傳統抗生素和化學消毒劑的應用雖然能起到防治病害的作用, 但同時也會帶來藥殘和耐藥性等問題。中草藥是天然藥物, 具有毒性低、易降解、安全環保等特點, 王印庚等[13]發現穿心蓮、大青葉、金銀花和川芎4種中草藥對海參腐皮綜合癥4種重要病原菌燦爛弧菌、假交替單胞菌、哈維氏弧菌和惡臭假單胞菌有較好的抑菌效果; 侯文久等[14]發現訶子、五倍子、牡丹皮、石榴皮等8種草藥對海參腐皮綜合癥病原菌黃海希瓦氏菌有較好的抑菌活性。

人參(Panax ginseng C.A.Mey.)是一種名貴的藥用植物, 自古以來都有“百草之王”的美譽, 是聞名遐邇的“東北三寶”之一。研究表明人參具有提高哺乳動物機體免疫、增強機體適應性、調節內分泌和抗腫瘤等效果[15—17]。人參的藥用價值主要體現在其根中, 需6、7年才能收獲取得, 而莖葉中其有效成分較少[18], 但也含有皂苷類、黃酮類、有機酸類、多糖類等多種化學有效成分[19, 20], 每年均可采摘價格也有很大優勢, 因此同樣具有較好的藥用價值。許多研究表明人參莖葉中所含有的藥用有效成分可通過某種方法提取分離出來, 使得人參的價值可以得到最大的利用[19—22]。人參莖葉的有效成分本對水產動物、低等動物的影響暫無報道, 但對畜禽、哺乳動物的影響有相關研究。目前在水產中還沒有關于人參莖葉應用的報道, 本實驗通過不同劑量的人參莖葉提取物與飼料預混投喂, 以探討不同劑量人參莖葉提取物對刺參生長、免疫及抗病的影響, 為刺參新型中草藥免疫增強劑的研究和臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗刺參購于遼寧大連獐子島集團有限公司,初始重量(4.91±0.17) g。人參莖葉提取物由北京中農勁騰生物技術有限公司提供。實驗基礎飼料的配方見表1。將人參莖葉提取物干燥并碾磨成粉狀, 然后在每千克基礎飼料中分別添加10、20、40和80 g, 對照組不添加, 將實驗飼料混合均勻100目過篩, 30℃風干并儲存于–20℃冰箱備用。

1.2 養殖實驗

養殖實驗分 4個實驗組和1個對照組, 每組 3個重復, 分別飼養在 120 L容量的塑料桶中, 每個塑料桶加水量為 100 L, 并投入兩張聚乙烯網片供刺參棲息和攝食, 每個水桶放20只刺參。正式實驗前, 對刺參進行暫養, 投喂基礎飼料, 使刺參逐漸適應新的環境。實驗前饑餓刺參24h, 并稱重記錄。實驗期間溶氧≥6 mg/L, 鹽度 28‰—32‰, pH 8.0±0.3, 每天早上全量換水并吸除糞便及殘餌, 新水為經砂石過濾的新鮮海水, 每天投喂一次實驗飼料, 投喂量為刺參體重的5%, 養殖周期為30d。

1.3 樣品的采集與處理

在養殖實驗結束后, 每桶隨機選取 5只刺參, 用 1 mL無菌注射器分別于各刺參體腔中抽取等量體腔液并混合均勻, 取 300 μL體腔液與抗凝劑(0.02 mol/L EGTA, 0.48 mol/L NaCl, 0.019 mol/L KCl, 0.068 mol/L Tris-HCl, pH 7.6)[23]按體積比為 1∶1混勻制成抗凝體腔液, 用于總細胞計數、吞噬活性和呼吸暴發的測定; 700 μL體腔液經離心 10min (3000×g, 4℃), 上清液即無細胞體腔液, 用于體液溶菌酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、總一氧化氮合酶活性的測定。若不能及時測定將待測樣本于–80℃下保存, 測定時需將在–80℃保存的樣本先轉移到冰塊中解凍, 再用于其他免疫指標的測定。

表1 基礎飼料配方及營養組成(干物質基礎)Tab. 1 The nutritional composition of the dry matter in the basal diet

1.4 測定方法

特定生長率 在養殖實驗結束后, 對刺參饑餓24h后計數并稱重, 計算特定生長率。

Wt為刺參終末體重, W0為刺參初始體重, t為養殖實驗的天數。

體腔總細胞計數 體腔液總細胞計數采用血球計數板, 在 40×10倍光學顯微鏡下稀釋一倍后直接計數, 計算出每毫升體腔液中體腔細胞數目。

細胞吞噬活性測定 吞噬活性的測定采用中性紅法[24, 25]。結果用全波長酶標儀在540 nm波長處測吸光值, 以試驗條件下每 106個體腔細胞對應的吸光值來表示吞噬活性。

細胞呼吸暴發活力(O2–)測定 超氧陰離子(O2–)的測定采用四氮唑藍測定法[26]。以KOH/DMSO作為空白對照, 利用酶標儀于波長630 nm處測定吸光值A630, 其定義為在試驗條件下每l06個體腔細胞對應的吸光度值。

溶菌酶活性測定 溶菌酶活力通過濁度比色法測定[27, 28]。反應底物為用磷酸緩沖液 PBS (0.05 mol/L、pH=6.2)配制的0.2 mg/mL溶壁微球菌粉(Sigma)懸液。100 μL無細胞體腔液與1.9 mL菌懸液混合, 在25℃下反應。在530 nm波長下, 分別在0.5min和4.5min測定吸光值(OD)。以每毫升反應液每分鐘使含菌酶液吸光值減少 0.001定義為一個酶活力單位(U/mL)。

酚氧化酶活性測定 酚氧化酶的測定使用左旋多巴(L-DOPA)作為底物, 與酚氧化酶反應后以光密度來檢測酚氧化酶活性[29]。取50 μL無細胞體腔液、50 μL磷酸緩沖液PBS (0.1 mol/L, pH 6.0) 和100 μL左旋多巴(L-DOPA, 0.01 mol/L)加入到96孔板中, 于 25℃下反應 10min, 立即放入酶標儀, 在490 nm處進行吸光度測定, 每分鐘測定一次吸光度,連續測定10min, 以試驗條件下每毫升體腔液每分鐘吸光度值每增加0.001定義為一個酶活力單位(U/mL)。

超氧化物歧化酶(SOD)的活性測定 超氧化物歧化酶(SOD)的活性測定是根據羥胺法來測定。SOD能通過抑制黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應體系中產生的超氧陰離子自由基來判斷, 產生的超氧陰離子自由基可與其他物質顏色反應, 可以通過光密度來測定[30], 采用 SOD檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)和 96孔板檢測, 結果使用酶標儀在550 nm處測吸光值。以每毫升體腔液中每分鐘抑制率達50%的酶量定義為一個活力單位(U/mL)。具體表示為每毫升體腔液中SOD的活力單位。

過氧化氫酶(CAT)的活性測定 過氧化氫酶的活性測定采用鉬酸銨比色法[31, 32]。CAT可催化H2O2釋放出氧氣, 迅速加入鉬酸銨可終止反應, 而多余的 H2O2與鉬酸銨作用生產黃色絡合物, 其在410 nm處有最大吸收峰, 因此可以通過鉬酸銨比色法來測定過氧化氫酶的活性。采用CAT檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)和96孔板測定, 以每毫升體腔液每秒分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位(U/mL)。

酸性磷酸酶(ACP)活性測定 酸性磷酸酶(ACP)的測定采用磷酸苯二鈉法, ACP在酸性條件下可以分解磷酸苯二鈉產生游離酚和磷酸, 產生的酚與 4-氨基安替吡啉以及鐵氰化鉀反應生成紅色醌衍生物, 利用光密度法在520 nm處測吸光值來確定酶活。采用酸性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)和 96孔板進行檢測, 依據試劑盒的操作手冊要求進行實驗。酶活定義為37℃時, 每100 mL體腔液在30min內產生1 mg硝基酚為l個酶活單位(U/100mL)。

總一氧化氮合酶(T-NOS)活性測定 一氧化氮合酶(NOS)可以催化L-精氨酸生產一氧化氮(NO),一氧化氮(NO)再被氧化成亞硝酸鹽(NO2–)和硝酸鹽(NO3–), 硝酸鹽(NO3–)在硝酸還原酶的作用下生產亞硝酸鹽(NO2–), 通過加入 Griess試劑將所有的亞硝酸鹽(NO2–)轉變成有色化合物, 可以通過530 nm處的吸光值來確定酶活[33, 34]。采用一氧化氮合酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)和96孔板測定,酶活定義為在試驗條件下每毫升體腔液每min生成1 μmol NO 為1個酶活性單位(U/mL)

1.5 攻毒實驗

攻毒實驗使用病原菌燦爛弧菌, 方法參照 Liu[35]和孫永欣等[36]的方法。做適當修改。在養殖實驗結束后, 每個實驗桶隨機選取12只刺參放入20 L含燦爛弧菌(107cells/mL)的海水中不間斷充氣養殖 7d,攻毒實驗期間不進行投喂。觀察刺參的發病情況,并對刺參的健康率(刺參中未出現發病癥狀和死亡的比例)進行統計。發病表現為體壁潰爛和腫嘴, 體壁潰爛癥狀為出現白藍色潰瘍表面, 并伴有大量黏液; 腫嘴癥狀表現為嘴部肌肉呈透明松弛狀, 并無法閉合[37]。

1.6 統計分析

數據結果采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)以及鄧肯(Duncan)多重比較, 當P＜0.05時結果存在顯著差異。

2 結果

2.1 人參莖葉提取物對刺參特定生長率的影響

與對照組(0 g/kg)相比, 基礎飼料中加入人參莖葉提取物能不同程度地促進刺參的生長。數據表明刺參特定生長率的提高與人參莖葉提取物的添加量不成正比, 特定生長率最低的為對照組的 0.66%,最高為40 g/kg人參莖葉提取物添加組的0.88%, 但各添加組與對照組之間均無顯著性差異(P＞0.05)(表2)。

2.2 人參莖葉提取物對刺參體腔總細胞數、細胞吞噬、呼吸暴發的影響

與對照組(0 g/kg)相比, 在基礎飼料中添加高劑量的人參莖葉提取物時, 對刺參體腔總細胞數、細胞吞噬活性和呼吸暴發強度有增強作用。其中80 g/kg人參莖葉提取物添加組刺參的體腔細胞總數、呼吸暴發強度都顯著高于對照組(P＜0.05), 細胞吞噬活性顯著高于對照組和其余人參莖葉提取物添加組(P＜0.05); 40 g/kg人參莖葉提取物添加組的細胞吞噬活性要顯著高于 20 g/kg人參莖葉提取物添加組、10 g/kg人參莖葉提取物添加組和對照組(P＜0.05), 體腔細胞總數和呼吸暴發強度相比對照組有不同程度提高, 但無顯著差異(P＞0.05); 20 g/kg人參莖葉提取物添加組與 10 g/kg人參莖葉提取物添加組的體腔細胞總數、細胞吞噬活性和呼吸暴發強度與對照組相比均無顯著差異(P＞0.05)(表3)。

2.3 人參莖葉提取物對刺參體液免疫指標的影響

與對照組(0 g/kg)相比, 人參莖葉提取物高劑量添加組均能不同程度提高刺參體液免疫指標各酶活力, 而人參莖葉提取物中低劑量組引起刺參部分體液免疫指標的降低。其中, 80 g/kg人參莖葉提取物添加組刺參的超氧化物歧化酶活力、總一氧化氮合酶的活力都顯著高于對照組及其余各添加組(P＜0.05), 酚氧化酶活力和過氧化氫酶活力顯著高于10 g/kg人參莖葉提取物組(P＜0.05)但與其余各組無顯著差異(P＞0.05); 40 g/kg人參莖葉提取物添加組與對照組相比, 各體液免疫指標均有提高, 但均無顯著差異(P＞0.05); 20 g/kg人參莖葉提取物添加組和 10 g/kg人參莖葉提取物添加組的部分體液免疫指標要低于對照組, 但無顯著差異(P＞0.05); 在本實驗條件下, 對照組與其余人參莖葉提取物不同劑量添加組在溶菌酶和酸性磷酸酶活力上無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 攻毒實驗

人工感染刺參腐皮綜合癥病原菌-燦爛弧菌 7d,刺參的健康率隨人參莖葉提取物添加量增加而提高。80 g/kg人參莖葉提取物添加組在為期7d的感染試驗后的健康率為 80.56%, 要顯著高于對照組(0 g/kg)的58.33%和10 g/kg人參莖葉提取物添加組的55.56%(P＜0.05), 但與20 g/kg人參莖葉提取物添加組(66.67%)和 40 g/kg人參莖葉提取物添加組(69.44%)無顯著差異(P＞0.05); 40 g/kg人參莖葉提取物添加組和 20 g/kg人參莖葉提取物添加組刺參經7d感染試驗后的健康率不同程度高于對照組和10 g/kg人參莖葉提取物添加組, 但與其余各組均無顯著差異(P＞0.05)(圖1)。

表2 人參莖葉提取物對刺參特定生長率的影響(平均值±標準誤, n=3)Tab. 2 Effects of the extracts from the stem and leaf of ginseng on the specific growth rate of Apostichopus japonicus (SGR, %/d, means± SE, n=3)

表3 人參莖葉提取物對刺參體腔總細胞數、細胞吞噬、呼吸暴發的影響(平均值±標準誤, n=3)Tab. 3 Effects of the extracts from the stem and leaf of ginseng on the total coelomocytes counts, the phagocytic assay and the respiratory burst activity in Apostichopus japonicas (means±SE, n=3)

表4 人參莖葉提取物對刺參體液免疫指標的影響(平均值±標準誤, n=3)Tab. 4 Effects of the extracts from the stem and leaf of ginseng on the humoral immunity of Apostichopus japonicas (means±SE, n=3)

3 討論

3.1 人參莖葉提取物對刺參生長的影響

王本祥等[38]發現人參莖葉皂苷可促進未成年小鼠、大鼠及豬的生長, 這可能與其促進RNA和蛋白質合成作用有關, 其他研究也表明人參莖葉皂苷也能促進雛雞的生長[39]。在本實驗的30d投喂養殖周期內, 投喂人參莖葉提取物組較對照組的生長率有一定提高, 但效果不明顯, 這可能使由于人參莖葉提取物種人參皂苷含量較低所致。生長率最高的人參莖葉提取物投喂量是在40 g/kg, 而再增加投喂量至80 g/kg時, 生長率反而下降, 具體原因尚不明確,有待進一步研究人參莖葉提取物添加量與飼料利用率的關系。

3.2 人參莖葉提取物對刺參免疫細胞的影響

刺參體腔中含有大量參與免疫防御過程的細胞,包括吞噬變性細胞、有色和無色球形細胞、祖原細胞、晶體細胞、振顫細胞和血細胞[40], 它們具有吞噬和消化異物等功能, 細胞在吞噬異物或病原的過程中也會產生具有強烈殺傷能力的超氧陰離子自由基O–, 它的強弱直接反應細胞的殺傷效能[41]。趙蕭蕭等[42]研究發現人參莖葉多糖能提高小鼠巨噬細胞的吞噬和淋巴細胞的增殖, 人參莖葉提取物由于含有人參莖葉多糖, 對刺參細胞免疫也有著顯著影響,當投喂人參莖葉提取物添加量達到20 g/kg時, 刺參體腔總細胞數較對照有提高, 而當添加量達到 80 g/kg時能顯著提高刺參體腔細胞總數; 同樣, 人參莖葉提取物添加量大于等于 40 g/kg時能顯著提高刺參體腔細胞的吞噬能力; 超氧陰離子的含量在大于等于40 g/kg時才有提高, 并且80 g/kg的添加量能顯著提高刺參體腔細胞呼吸暴發的活力。這表明低劑量的人參莖葉提取物不能有效提高刺參的細胞免疫能力, 但隨著劑量的增加, 刺參細胞免疫力也逐步上升。3.3 人參莖葉提取物對刺參體液免疫指標的影響

圖1 人參莖葉提取物對刺參抗燦爛弧菌的影響Fig. 1 Effects of the extracts from the stem and leaf of ginseng on the resistance to V. splendidus in Apostichopus japonicus

刺參除了細胞免疫外還有著多種對抗外界病原及異物的體液免疫, 由于刺參只具有非特異性免疫,因此這些免疫指標在刺參體液免疫中起著不可替代的重要作用。人參莖葉皂苷已被證明可以提高小鼠超氧化物歧化酶的活性[43], 在本實驗中, 投喂人參莖葉提取物不同添加量的飼料在4周的實驗周期內,與對照組相比體液溶菌酶(LSZ)、酚氧化酶(PO)、過氧化氫酶(CAT)和酸性磷酸酶(ACP)的活性都無顯著性提高, 但40 g/kg和80 g/kg添加量組刺參體液中的這四種酶與對照組相比都有提高; 當人參莖葉提取物添加量達到80 g/kg時, 刺參體液中的超氧化物歧化酶(SOD)和總一氧化氮合酶(T-NOS)相比對照組具有顯著提高, 而其余各處理組與對照組酶活性相差不大。對刺參體液免疫指標而言, 在實驗條件下最高添加量組對免疫指標影響最大, 大部分實驗組對刺參免疫指標的影響不夠顯著, 有待做時間與藥效之間關系的進一步研究。

3.4 人參莖葉提取物對刺參抗病能力的影響

目前還未見有報道人參莖葉提取物對水產動物抗病力影響的研究, 實驗結果表明人參莖葉提取物在20 g/kg以上時可以提高刺參的健康率, 其中投喂含 80 g/kg的人參莖葉提取物飼料組與空白對照組相比, 效果最好, 這與提升刺參免疫力效果的結果相一致, 這可能是人參莖葉提取物通過提高刺參的非特異性免疫進而提升其對燦爛弧菌病原感染的抵抗力的結果。

在本實驗中, 人參莖葉提取物的添加量達到最高的80 g/kg時, 刺參的免疫和抗病能力均顯著最高,這表明人參莖葉提取物可作為一種高價值的水產免疫增強劑得到應用。與此同時, 人參莖葉提取物是否能提高刺參的營養、藥用價值以及更高添加量能否進一步提高刺參的生長、免疫和抗病力有待進一步的研究。

4 結論

本實驗首次將人參莖葉提取物用于水產中, 作為高價值水產養殖動物的免疫增強劑, 其對刺參的生長、免疫和抗病具有一定的影響。結合本次實驗所有數據, 表明飼料中添加人參莖葉提取物可以提高刺參的免疫能力, 同時也能減低刺參感染腐皮綜合癥的幾率, 但對促進刺參生長效果不明顯, 本次試驗的最佳添加量為80 g/kg。

[1] McElroy S. Beche-de-mer species of commercial value-an update [J]. SPC Bêche-de-mer Information Bulletin, 1990, 2: 2—7

[2] Wang Y H, Wang C, Guo L P, et al. Analysis of the nutritional components in four kinds of holothuroidea [J]. Periodical of Ocean University of China, 2010, 40(7): 111—114 [王遠紅, 王聰, 郭麗萍, 等. 海參科 (Holothuriidae) 中 4 種海參的營養成分分析. 中國海洋大學學報: 自然科學版, 2010, 40(7): 111—114]

[3] Fan H Z. Ginseng of the sea-- Research and development on medical efficacy of sea cucumber and its ingredient [J]. Chinese Journal of Marine Drugs, 2001, 20(4): 37—44 [樊繪曾. 海參: 海中人參——關于海參及其成分保健醫療功能的研究與開發. 中國海洋藥物, 2001, 20(4): 37—44]

[4] Kaneko M, Kisa F, Yamada K, et al. Structure of neuritogenic active ganglioside from the sea cucumber Stichopus japonicus [J]. European Journal of Organic Chemistry, 1999, (11): 3171—3174

[5] Tian F, Zhang X, Tong Y, et al. Research Paper PE, A new sulfated saponin from sea cucumber, exhibits anti-angiogenic and anti-tumor activities in vitro and in vivo [J]. Cancer Biology & Therapy, 2005, 4(8): 874—882

[6] Miyamoto T, Togawa K, Higuchi R, et al. Six newly identified biologically active triterpenoid glycoside sulfates from the sea cucumber cucumaria echinata [J]. Liebig’s Annalen der Chemie, 1990, (5): 453—460

[7] Shimada S. Antifungal steroid glycoside from sea cucumber [J]. Science, 1969, 163(3874): 1462

[8] Aminin D L, Koy C, Dmitrenok P S, et al. Immunomodulatory effects of holothurian triterpene glycosides on mammalian splenocytes determined by mass spectrometric proteome analysis [J]. Journal of Proteomics, 2009, 72(5): 886—906

[9] Brekhman, HW Y. A review of pharmacological and clinical research of biologically active substances of marine origin in the soviet far east (1949～1969) [J]. Food—Drug from the Sea (Youngken HW ed)．Marine Technology Society, 1970, 359

[10] Li Z, Wang H, Li J, et al. Basic and clinical study on the antithrombotic mechanism of glycosaminoglycan extracted from sea cucumber [J]. Chinese Medical Journal, 2000, 113(8): 706—711

[11] Li L F, Xiang D Z, Gao B. Research of Stichopus japonicus acid mucopolysaccharide (SJAMP) in treatment of chronic viral hepatitis B [A]. Fourth Symposium on Chinese Oceanology and Limnology Drugs [C]. Qingdao, 1994, 174[李麗芬, 相大崢, 高斌. 刺參酸性黏多糖治療慢性乙型病毒性肝炎的研究. 第四次中國海洋湖沼藥物學術研討會論文集. 青島. 1994, 174].

[12] Wang Y G, Fang B, Zhang C Y, et al. Etiology of skin ulcer syndrome in cultured juveniles of Apostichopus japonicus and analysis of reservoir of the pathogens [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2006, 13(4): 610—616 [王印庚,方波, 張春云, 等. 養殖刺參保苗期重大疾病“腐皮綜合征”病原及其感染源分析. 中國水產科學, 2006, 13(4): 610—616]

[13] Wang Y G, Leng M, Chen X, et al. In vitro bacteriostatic effect of Chinese herbs against causative pathogens of skin ulcer syndrome in sea cucumber Apostichopus japonicus [J]. Progress in Fishery Sciences, 2009, 30(2): 1—7 [王印庚,冷敏, 陳霞, 等. 中草藥對刺參腐皮綜合征病原菌的體外抑菌試驗. 漁業科學進展, 2009, 30(2): 1—7]

[14] Hou W J, Yang F Y, Wang W X. In vitro Bacteriostatic effect of Chinese herbs against causative pathogens of skin ulcer syndrome in sea cucumber Apostichopus japonica [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(5): 76—80[侯文久, 楊鳳影, 王維新. 中草藥對刺參腐皮綜合癥病原菌的抑菌試驗. 中國農學通報, 2013, 29(5): 76—80]

[15] Coon J T, Ernst E. Panax ginseng [J]. Drug Safety, 2002, 25(5): 323—344

[16] Scaglione F, Ferrara F, Dugnani S, et al. Immunomodulatory effects of two extracts of panax ginseng C.A. Meyer [J]. Drugs Under Experimental and Clinical Research, 1989, 16(10): 537—542

[17] Shin H R, Kim J Y, Yun T K, et al. The cancer-preventive potential of panax ginseng: a review of human and experimental evidence [J]. Cancer Causes & Control, 2000, 11(6): 565—576

[18] Huang X S. Determination of ginsenoside in ginseng stem&leaf extracts and ginseng root by HPLC [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2001, 26(3): 173—175[黃新生. 高效液相色譜法測定人參莖葉浸膏及人參根中的人參皂苷含量. 中國中藥雜志, 2001, 26(3): 173—175]

[19] Shen S C, Sun X J, Tang X H, et al. Chemical constituents of stems and leaves of panax ginseng C.A. Meyer [J]. Journal of Qiqihar University (Natural Science Edition), 2008(03): 43—46 [申書昌, 孫秀佳, 唐曉慧, 等. 人參莖葉的化學成分研究. 齊齊哈爾大學學報, 2008(03): 43—46]

[20] Li K K, Yang X W. Advances of studies on chemical constituents in stems and leaves of ginseng [J]. Modern Chinese Medicine, 2012, 14(1): 47—50 [李珂珂, 楊秀偉.人參莖葉化學成分的研究進展. 中國現代中藥, 2012, 14(1): 47—50]

[21] Yu J, Bai Z C, Fu C M. Research on the technology of extraction and purification of total saponin from the stem and leaf of panax ginseng [J]. Journal of Southwest Agricultural University, 2004, 26(4): 479—482 [于杰, 白志川, 付超美.人參莖葉總皂甙提取精制工藝研究. 西南農業大學學報, 2004, 26(4): 479—482]

[22] Zhang X, Guo L P, Liu Y J, et al. Study on the extraction process of saponins in stems and Leaves of panax ginseng by different methods [J]. Journal of Jilin Agricultural Science and Technology College, 2013, 22(3): 21—24 [張旭, 郭麗萍, 劉亞杰, 等. 不同方法提取人參莖葉皂苷工藝研究.吉林農業科技學院學報, 2013, 22(3): 21—24]

[23] Xing J, Leung M, Chia F. Quantitative analysis of phagocytosis by amebocytes of a sea cucumber, Holothuria leucospilota [J]. Invertebrate Biology, 1998: 67—74

[24] Cao Q, Lin Z. Antitumor and anti-angiogenic activity of ganoderma lucidum polysaccharides peptide [J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2004, 25: 833—838

[25] Zhang Q, Ma H, Mai K, et al. Interaction of dietary bacillus subtilis and fructooligosaccharide on the growth performance, non-specific immunity of sea cucumber, Apostichopus japonicus [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2010, 29(2): 204—211

[26] Song Y, Hsieh Y. Immunostimulation of tiger shrimp (penaeus monodon) hemocytes for generation of microbicidal substances: analysis of reactive oxygen species [J]. Developmental & Comparative Immunology, 1994, 18(3): 201—209

[27] Chen X R, Zhang W B, Mai K S, et al. Effects of dietary glycyrrhizin on growth, immunity of sea cucumber and its resistance against Vibrio splendidus [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2010, 34(4): 731—738 [陳效儒, 張文兵, 麥康森, 等. 飼料中添加甘草酸對刺參生長、免疫及抗病力的影響.水生生物學報, 2010, 34(4): 731—738]

[28] Lin S, Mao S, Guan Y, et al. Effects of dietary chitosan oligosaccharides and bacillus coagulans on the growth, innate immunity and resistance of koi (Cyprinus carpio koi) [J]. Aquaculture, 2012, 342—343: 36—41

[29] Ashida M, S?derh?ll K. The prophenoloxidase activating system in crayfish [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1984, 77(1): 21—26

[30] Wang S, Chen J. The protective effect of chitin and chitosan against vibrio alginolyticus in white shrimp Litopenaeus vannamei [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2005, 19(3): 191—204

[31] Cheng L J, Meng Z. Molybdate colorimetric method for determination of catalase in serum [J]. Chinese Journal of Clinical Laboratory Science, 1994, 12(1): 6—8 [程魯京, 孟澤. 鉬酸銨顯色法測定血清過氧化氫酶. 臨床檢驗雜志, 1994, 12(1): 6—8]

[32] Goth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range [J]. Clinica Chimica Acta, 1991, 196(2): 143—151

[33] Green L C, Wagner D A, Glogowski J, et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids [J]. Analytical Biochemistry, 1982, 126(1): 131—138

[34] Marzinzig M, Nussler A K, Stadler J, et al. Improved methods to measure end products of nitric oxide in biological fluids: nitrite, nitrate, and S-nitrosothiols [J]. Nitric Oxide,1997, 1(2): 177—189

[35] Liu Z, Ma Y, Yang Z, et al. Immune responses and disease resistance of the juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus induced by metschnikowia sp. C14 [J]. Aquaculture, 2012, 368—369: 10—18

[36] Sun Y X. Improving effects of astragalus polysaccharides (APS) on non-specific immune responses and productive performance of sea cucumber (Apostichopus joponicus) [D]. Dalian University of Technology, 2008 [孫永欣. 黃芪多糖促進刺參免疫力和生長性能的研究. 博士學位論文, 大連理工大學, 2008]

[37] Ma Y X, Xu G R, Zhang E P, et al. The etiology of acute preistome edema disease in cultured juveniles of Apostichopus japonicus [J]. Journal of Fisheries of China, 2006, 30(3): 377—382 [馬悅欣, 徐高蓉, 張恩鵬, 等. 仿刺參幼參急性口圍腫脹癥的細菌性病原. 水產學報, 2006, 30(3): 377—382]

[38] Wang B X, Cui J C, Liu A J. The action of ginsenosides extracted from the stems and leaves of panax ginseng in promoting animal growth [J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 1982, (12): 899—904 [王本祥, 崔景朝, 劉愛晶. 人參莖葉皂甙促進動物生長的作用. 藥學學報, 1982, (12): 899—904]

[39] Yang H M, Xun C Y, Wang J Y, et al. Effects of ginseng stems and leaves saponins (GSLS) on weight performance and blood parameters of Chicken [J]. Feed Research, 1994, (6): 19—20 [楊煥民, 徐長友, 王建勇, 等. 人參莖葉皂甙對雛雞增重及血液的作用. 飼料研究, 1994, (6): 19—20]

[40] Ratcliffe N A, Rowley A F. Invertebrate blood cells [Z]. New York: Academic press New York. 1980, 513—526

[41] Wang S X, Ye H B, Yu X Q, et al. Analysis of sea cucumber immune mechanism [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2012, (25): 12553—12555 [王淑嫻, 葉海斌, 于曉清, 等. 海參的免疫機制研究. 安徽農業科學, 2012, (25): 12553—12555]

[42] Zhao X X, Wang J H, Ye S H, et al. Effects of the polysacchadde from ginseng leaves and stems on immunological function of mouse [J]. China Brewing, 2009, (3): 56—58 [趙蕭蕭, 王際輝, 葉淑紅, 等. 人參莖葉多糖對小鼠免疫功能的影響. 中國釀造, 2009, (3): 56—58]

[43] Guo S, Chen M Q, Zhao J X, et al. Effects of panax ginseng saponin (PGS) on LPO and SOD in ADM-injuried mice [J]. Journal of Norman Bethune University of Medical Science, 1996, (3): 239—240 [郭頌, 陳滿秋,趙節緒, 等. 人參莖葉皂甙對阿霉素中毒小鼠過氧化脂質和超氧化物歧化酶的影響. 白求恩醫科大學學報, 1996, (3): 239—240]

EFFECTS OF GINSENG STEM AND LEAF EXTRACTS ON THE GROWTH, IMMUNITY AND THE RESISTANCE TO DISEASES IN SEA CUCUMBERS (APOSTICHOPUS JAPONICAS)

GUO Jun, YU Jun, CHEN Yong-Liang, YANG Xian-Le, HU Kun and CAO Hai-Peng
(Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To investigate the actual effects of ginseng stem and leaf extracts in the farming of sea cucumbers (Apostichopus japonicas), we conducted experiments to study the growth, immunity and the resistance to diseases in sea cucumbers treated with ginseng extracts. The sea cucumbers had an initial body weight of (4.91±0.17) g, and were fed with ginseng stem-leaf extracts at the levels of 10, 20, 40 and 80 g per kg for 30 days. Basal diet without ginseng abstract served as the control treatment. The specific growth rates (SGR) of sea cucumbers showed no changes in response to the increase in ginseng stem-leaf extracts. Compared to the control, sea cucumbers fed with 80 g/kg ginseng stem-leaf extracts showed significantly higher levels in total coelomocytes count (TCC), respiratory burst (RB) activity, phagocytosis, superoxide dismutase (SOD), and total nitric oxide synthase (T-NOS) (P＜0.05). Enhancement in phagocytosis was also observed in sea cucumbers fed with 40 g/kg ginseng stem-leaf extracts (P＜0.05). However, there were no significant differences in other immune parameters between the 10 g/kg group, the 20 g/kg group, and the control group (P＞0.05). Results of the challenge trial suggested that sea cucumbers fed with 20 g/kg, 40 g/kg and 80 g/kg ginseng stem-leaf extracts were healthier than the control. The health rate of sea cucumbers fed with 80 g/kg ginseng stem-leaf extracts was 80.56%, which was significantly higher than the control and the 10 g/kg group (P＜0.05). Therefore, we concluded that the treatment with ginseng stem-leaf extracts might improve the immunity and the resistance to diseases in sea cucumbers and thus could be used as an immunity enhancer in the farming of the sea cucumbers.

Sea cucumber; Ginseng stem-leaf extracts; Growth; Immunity; Disease resistance

S968.9

A

1000-3207(2015)06-1085-08

10.7541/2015.143

2014-10-15;

2015-01-11

科技部863課題“新型環境友好型漁藥的研制與漁藥安全性評價”(2011AA10A216); 上海高校水產一級學科建設與上海高校知識服務平臺項目(ZF1206)資助

珺郭 (1990—), 男, 湖南永州人; 碩士; 主要研究方向為水產動物醫、藥學。E-mail: 475579407@qq.com

楊先樂(1948—), 教授; E-mail: xlyang@shou.edu.cn