白鯧魚腸道中產蛋白酶菌的篩選、鑒定及產酶條件

李 靜，陳維新，鄧毛程

（廣東輕工職業技術學院，廣東 廣州 510300）

0 引言

蛋白酶是重要的水解酶類，主要由動物、植物和微生物等生物合成，目前在工業化運用中最為成功、產量最大[1]，并廣泛應用于洗滌劑、食品、藥品、皮革、紡織和廢物處理等工業領域.由于水產品蛋白酶酶解產物具有較高的營養價值和功能特性，含有豐富的生物活性肽、氨基酸以及高度不飽和脂肪酸等保健成分，近年來，蛋白酶開始出現在水產品加工過程中，被廣泛應用于飼料、食品、化工、醫藥等各個領域[2].蛋白酶制劑在整個酶制劑市場的占有率已超過65%[3]，且微生物來源的酶制劑已居主導地位.微生物來源的蛋白酶除了具備動、植物蛋白酶的特性，還具有產量高、生產成本低、易于實現工業化生產等優點[4].目前，應用于蛋白酶工業化生產的微生物較多，細菌主要有地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等芽胞桿菌屬微生物[4-5]，但國內目前在蛋白酶制劑的研究開發方面與國外相比，仍有較大差距，因此從特殊來源、特殊環境，例如魚類腸道的低溫環境中篩選產酶能力強的新型菌種具有重要意義.本試驗從廣東省沿海特定水產品海水白鯧的腸道中篩選高產蛋白酶產生菌株，通過富集培養、平板篩選、搖瓶復篩等綜合手段獲得一株產酶能力較強的菌種EF21，采用形態特征、生理生化試驗，以及分子鑒定16S rDNA 分析方法鑒定該菌在進化系統中的種屬，并以蛋白酶活力作為判斷指標，研究了產酶最優氮源、初始pH、溫度、最佳產酶時間等，擬通過優化各發酵參數來提高產酶能力，以期獲得較好的蛋白酶產生菌株，為將來進一步開展酶學特性研究、工業化生產提供基礎數據.

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

海水白鯧魚：來自瓊州海峽；酪氨酸：分析純，Sigma 公司；酪蛋白及其他試劑均為國產分析純.

富集培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

平板篩選培養基：葡萄糖5 g/L，酪蛋白10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0.

斜面培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0.

種子培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

基礎發酵基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

1.2 儀器與設備

FA2204 型電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；JA5003 型精密電子天平：杭州中拓儀器有限公司；YX-280D 型蒸汽滅菌器：合肥華泰醫療設備有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-100-Z 型生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；A200 型基因擴增儀：杭州朗基科學儀器有限公司；RDYSP1Z 型核酸電泳儀：北京榮陽經典科技有限公司；GI-1 型凝膠成像系統：通寶達成科技（北京）有限公司；S-3000N 型掃描電鏡、H-7650 型透射電鏡：日本日立公司.

1.3 平板篩選

剖開鮮活的白鯧魚，取出腸道，經高速勻漿機搗碎，稱取10 g 搗碎組織，接入100 mL 的富集培養基，置于24 ℃、200 r/min 的條件下培養20 h.將富集培養基稀釋成系列濃度，分別涂布于平板篩選培養基上，在24 ℃下培養48 h，觀察各菌落周圍是否有透明圈，挑取具有較大透明圈的單菌落，接入斜面培養基，經培養，備用.

1.4 搖瓶篩選

以1.3 中篩選所得的各菌株為篩選對象，將它們接入種子培養基，在24 ℃、200 r/min 的條件下振蕩培養16 h，以10% 的接種量，將種子培養液接入發酵培養基，于同樣條件下進行發酵，在36～72 h 時間內定期測定發酵液的蛋白酶活力，比較各菌株的最高值，篩選出高產菌株.

1.5 高產菌種的鑒定

對優選菌株，采用普通光學顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察菌體形態.采用16S rDNA 進行分子生物學鑒定，首先提取高產菌株的16S rDNA，經PCR 擴增、純化，送至測序公司進行序列檢測，然后在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索同源性，以Neighbor-joining 法構建系統發育樹[6].參照《Bergy’s Manual of Determinative for Bacteriology》中的試驗方法[7]，對菌種進行生理生化特征分析.

1.6 菌種產蛋白酶的氮源

改變基礎發酵培養基的氮源，分別以酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸銨為唯一氮源，通過搖瓶發酵和測定發酵液中的蛋白酶活力，優選最佳的氮源.

1.7 菌種產酶的初始pH 和溫度

將培養基的初始pH 分別調節至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，接種后，于24 ℃、200 r/min 的條件下進行發酵.另外，將接種后的發酵培養基（pH 7.0）在不同溫度、200 r/min 的條件下進行發酵.在發酵過程中，定期測定發酵液中的蛋白酶活力，以最高值為依據，優選產酶的最佳初始pH 和溫度.

1.8 菌種產蛋白酶的時間

在最佳的溫度和初始pH 下，以最優化的培養基進行搖瓶發酵，每隔8 h 測定發酵液中的蛋白酶活力，根據蛋白酶活力變化情況，確定最佳的產酶時間.

1.9 蛋白酶活力的測定

采用Folin 試劑法測定發酵液中的蛋白酶活力[8].

樣品測定前，配制一系列濃度的酪氨酸溶液，分別吸取1 mL 酪氨酸溶液，與5 mL 的0.4 mol/L碳酸鈉溶液、1 mL 的Folin 試劑混合，于40 ℃水浴中顯色20 min，于660 nm 波長下測定吸光度.以酪氨酸濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程.

樣品測定時，先將酪蛋白溶于pH 7.0 的緩沖液，配制成20 g/L 的酪蛋白溶液，并置于40 ℃水浴中預熱；然后，將發酵液的pH 調節至7.0，于6 000 r/min、4 ℃下離心20 min，去除菌體，適當稀釋上清液，吸取1 mL 稀釋液，經40 ℃水浴預熱5 min，加入1 mL 酪蛋白溶液，置于40 ℃水浴中反應20 min；最后，加入2 mL 的0.4 mol/L 的三氯乙酸終止反應，經10 000 r/min 離心20 min，吸取1 mL 上清液，與5 mL 的0.4 mol/L 碳酸鈉溶液、1 mL 的Folin 試劑混合，于40 ℃水浴中顯色20 min.同時，需制備一個對照體系，即先將待測的蛋白酶液與三氯乙酸混合，于40 ℃水浴中作用20 min，使蛋白酶失活，再加入酪氨酸溶液，其余步驟同上.以對照體系為空白，在660 nm 的波長下測定吸光度.根據吸光度測定值和酪氨酸標準曲線，計算發酵液中的蛋白酶活力.

酶活力單位定義：在40 ℃和pH 7.0 的條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg 酪氨酸的酶量，以U表示.

2 結果與討論

2.1 蛋白酶產生菌的篩選

富集培養液經酪蛋白平板分離，挑取了62 株在菌落周圍具有明顯透明圈的菌株.這些菌株再經搖瓶發酵試驗，表現出不同的產酶能力，圖1 是產酶能力較高的8 株菌.從圖1 看出，菌種EF21發酵液的蛋白酶活力最高，故將其作為進一步研究的對象.

圖1 菌種篩選結果Fig.1 Screen result of 8 strains

2.2 高產菌種的鑒定

菌種EF21 的菌體經革蘭氏染色，在普通光學顯微鏡下觀察，呈陽性.在掃描電鏡（×8.0 k）、透射電鏡（×2.5 k）下觀察，如圖2 所示，菌體呈桿狀，周生鞭毛，大小為（2.1～4.2）μm ×（0.9～1.0）μm.菌種EF21 的16S rDNA 經擴增、測序，可獲得1 227 bp 的序列，在NCBI 中檢索該序列的同源性，發現其與許多蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）的同源性達96%～97%.采用Neighbor-joining 法構建系統發育樹，菌種EF21 的系統發育樹如圖3 所示，菌種EF21 與Bacillus cereus Bc（登錄號:KC814644.1）的親緣關系最近，因而可鑒定菌種EF21 為蠟樣芽胞桿菌.菌種EF21 的生理生化試驗結果如表1 所示，在表1 中還列舉了早期文獻報道的兩株蠟樣芽胞桿菌的生理生化特征[9-10]，通過比較，發現它們大部分特征相似，但菌種EF21 能夠在較低溫度下生長，估計與其來源于海洋環境有關.菌種EF21 與數據庫中菌種的最大同源性僅為97%，且生長溫度較低，可能是新發現的微生物菌種.

圖2 菌體在掃描電鏡和透射電鏡下的照片Fig.2 SEM and TEM photographs of strain EF21

圖3 菌種EF21 的系統發育樹Fig.3 The sequence phylogenetic analysis of strain EF21

2.3 氮源對產酶的影響

培養基分別采用不同的氮源，發酵結果如圖4所示.從圖4 可以看出，相對于無機氮源而言，有機氮源有利于菌種EF21 產蛋白酶，這與有機氮源含有誘導作用的肽鏈有關.其中，以蛋白胨為氮源，菌種EF21 的產酶效果最好，雖然菌種EF21 是新型菌種，但試驗結果與早期文獻[11]的其他菌種具有相同之處.

表1 菌種EF21 和兩株蠟樣芽胞桿菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain EF21 and two other Bacillus cereus

圖4 不同氮源對產蛋白酶的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the yield of protease

2.4 初始pH 和溫度對產酶的影響

初始pH 和溫度對菌種EF21 產蛋白酶的影響如圖5 所示.初始pH 過高或過低均不利于菌種EF21 產蛋白酶，適宜的初始pH 范圍為7.0～7.5，在pH 7.5 時的產酶量最大.溫度對產酶的影響較為明顯，16～24 ℃有利于菌種EF21 產蛋白酶，其中最佳的產蛋白酶溫度為20 ℃.偏堿性、較低溫度的產酶條件與海洋環境特征一致，表明菌種產酶特性與菌種來源密切相關.國內關于產蛋白酶的低溫菌種的報道不多，肖峰等[12]從黃海海域篩選得到一株產中性蛋白酶菌種Aranicola proteolyticus XF1，最適產酶溫度為25 ℃；王金富等[13]從南極海水中獲得3 株假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）的菌種和1 株科爾韋爾氏屬（Colwellia）的菌種，產蛋白酶的最適溫度為10 ℃左右.菌種EF21 產蛋白酶的溫度較低，在低溫環境中具有應用潛力.

圖5 初始pH 和溫度對產蛋白酶的影響Fig.5 Effect of fermentation conditions on the yield of protease

2.5 最佳產酶時間的確定

在產蛋白酶的最佳條件下，菌種EF21 的產酶時間曲線如圖6 所示.在發酵32 h 以內，產酶量較低；隨著時間延長，發酵液中蛋白酶活力逐漸增加，64 h 時達到最高；在發酵64 h 以后，由于營養物質竭盡和發酵液pH 下降，蛋白酶活力呈下降趨勢.本試驗條件下的最佳產酶時間為64 h，此時發酵液中蛋白酶活力達1 292 U/mL.在蛋白酶活性單位定義的相同情況下，發酵液中蛋白酶活力的較高水平一般為600～800 U/mL[5，14]；蔡婉玲等[1]報道了1 株產蛋白酶菌的突變株，其發酵液的蛋白酶活力達1 845 U/mL.相對于文獻報道的數據，菌種EF21 具有較強的產酶能力.

圖6 發酵時間對產蛋白酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the yield of protease

3 結論

從海水白鯧魚腸道中篩選得到一株蛋白酶高產菌種EF21，經鑒定，該菌種被確定為新發現的蠟樣芽胞桿菌.菌種EF21 產蛋白酶的最佳氮源為蛋白胨，最佳的初始pH、溫度和時間分別為pH 7.5、20 ℃和64 h.在最佳的產酶條件下，發酵液中蛋白酶活力達1 292 U/mL.菌種EF21 適宜在較低溫度下產酶，在低溫環境中具有巨大的應用潛力.由于該菌種是新發現的海洋微生物，其毒性試驗、所產蛋白酶的酶學性質以及發酵條件優化等工作仍有待繼續開展，進一步促進工業化應用.

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