普洱熟茶中黃酮醇類物質楊梅素、槲皮素和山奈酚的分離純化

關文玉,李燕麗,李艷芳,李加偉,史寅驊,李家華,*

(1.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南昆明 650201;2.梁河縣曩宋阿昌族鄉農業綜合服務中心,云南梁河 679200)

普洱熟茶中黃酮醇類物質楊梅素、槲皮素和山奈酚的分離純化

關文玉1,李燕麗1,李艷芳1,李加偉2,史寅驊1,李家華1,*

(1.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南昆明 650201;2.梁河縣曩宋阿昌族鄉農業綜合服務中心,云南梁河 679200)

本文以云南普洱熟茶為實驗材料,以不同濃度乙醇水溶液為洗脫液,利用MCI GEL CHP 20P(75～150 μm)樹脂色譜柱和SephadexTMLH-20葡聚糖凝膠色譜柱,并結合高效液相色譜(HPLC)法,對普洱熟茶中主要黃酮醇類物質進行了分離和定性。結果表明:普洱熟茶提取液濃縮后過MCI GEL CHP 20P(75～150 μm)樹脂色譜柱,經不同濃度(10%,30%,50%,70%,90%)乙醇溶液洗脫分離后,將獲得的70%和90%的洗脫液過SephadexTMLH-20葡聚糖凝膠色譜柱,70%的洗脫液經90%乙醇溶液洗脫分別獲得了HPLC純度為96.0%的楊梅素和HPLC純度為98.5%的槲皮素;90%的洗脫液經70%的乙醇溶液洗脫獲得了HPLC純度為95.6%的山奈酚。

普洱熟茶,黃酮醇類化合物,樹脂柱色譜,葡聚糖凝膠,HPLC

普洱茶是云南的特色茶,是國家地理標志性產品,研究表明,普洱茶具有減肥、降脂、防止動脈硬化、抗衰老、抗癌、擬菌、消炎、抗毒、抑菌等多種功效[1-5]。普洱茶在其加工過程中按后發酵工序的有、無可分為普洱熟茶和普洱生茶兩大類[6]。兩者不僅在品質特征上有明顯差異,在內含物的化學成分上也相差懸殊[7-8]。目前為止,國內外研究者對普洱茶生茶或曬青毛茶的植物化學開展了一定的研究。如:周志宏等從普洱茶原料曬青毛茶中分離鑒定出了包括兒茶素、黃酮及其苷類、酚酸類化合物在內的21個化合物,從云南云縣普洱茶中分離鑒定出了12個化合物,其中有兩個為新化合物普洱素(Puerin)A和B[9];林智等也從雙江縣普洱茶中分離鑒定出了楊梅素、山奈酚、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷,山奈酚-3-O-蘆丁糖苷,槲皮素,槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷等包括黃酮醇及其苷類在內的11種化合物[10]。但普洱熟茶的后發酵階段,在微生物、熱和多種復雜酶類的作用下,普洱熟茶中含天然酚類化合物在內的生化成分容易發生氧化,水解、異構、裂解等化學變化,形成聚合度更高的復雜多聚體,給以普洱熟茶為研究對象的植物化學研究帶來了較大的難度,從而制約了普洱熟茶功效的深度研究[11]。為此,本文以茶葉中主要的生理活性成分,同時對茶葉品質也有重要影響的黃酮醇類物質為研究目標,采用了有機溶劑提取以及傳統的柱色譜法對其開展了分離純化效果的探索性研究,旨在探討柱色譜法對普洱茶中黃酮醇類化合物的分離效果和深入開展普洱熟茶生化成分的精細化研究提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱熟茶 由大益集團提供(批次:201;生產日期:2012年4月10日);槲皮素(純度≥97.4%)、山奈酚(純度≥98%)、楊梅素(純度≥98%) 購于SIGMA公司;甲醇(色譜級,MADE IN USA),乙醇、磷酸為AR級 天津市風船化學試劑科技有限公司;超純水 實驗室自制;高效液相色譜儀(HPLC)分析裝置 美國Agilent 1200型高效液相色譜系統;TSKgel ODS-80TM色譜柱 4.6 mm×250 mm,5 μm,日本Tosoh公司;電子天平 型號:CP214,奧豪斯儀器(上海)有限公司;旋轉蒸發儀 德國IKARV 8V-C;EPED-E2-20TH易普易達實驗室級超純水器 南京易普易達科技發展有限公司;孔徑0.45 μm過濾膜 天津津騰實驗設備有限公司;砂芯過濾裝置 天津津騰實驗設備有限公司;MCI GEL CHP 20P 75～150 μm產于日本;SephadexTMLH-20 瑞典。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮醇類化合物的提取方法 稱取500 g普洱熟茶→加2 L 70%乙醇水溶液→室溫(提取24 h)→提取液→過濾→濾液減壓蒸餾去乙醇→濃縮提取液。(整個提取過程重復3次)

1.2.2 黃酮醇類化合物的分離純化方法 裝柱:色譜柱規格有7 cm×60 cm、5.5 cm×50 cm兩種,其中7 cm×60 cm的色譜柱中裝填20 cm高的MCI GEL CHP 20P(75～150 μm)樹脂,5.5 cm×50 cm的色譜柱裝填20 cm高的SephadexTMLH-20葡聚糖凝膠。裝填好的色譜柱經甲醇洗脫后再經純水洗凈備用。

濃縮提取液過直徑7 cm的樹脂MCI GEL CHP 20P(75～150 μm)色譜柱,依次用3倍體積10%乙醇溶液、2倍體積30%乙醇溶液、2倍體積50%乙醇溶液、2倍體積70%乙醇溶液、2倍體積90%乙醇溶液以9～10 mL·min-1流速進行梯度洗脫,將收集的洗脫液分別濃縮,獲得10%濃縮液、30%濃縮液、50%濃縮液、70%濃縮液和90%濃縮液。再將70%和90%的濃縮液分別過葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱,分別用不同濃度的乙醇水溶液以4～5 mL·min-1的流速洗脫,具體分離路線如圖1所示。

圖1 普洱熟茶黃酮醇類化合物的提取及分離路線圖Fig.1 Extraction and separation roadmap of flavonols in cooked Pu-erh tea

1.2.3 色譜條件 色譜柱:TSK gel ODS-80TM色譜柱。流動相:A相:0.2%磷酸水溶液;B相:80%甲醇水溶液,梯度從40% B到90% B,流速0.8 mL/min,40 min內完成,檢出波長360 nm,柱溫40 ℃,進樣量10 μL,每次完成后系統平衡7 min后再次進樣。流動相A、B均用0.45 μm的濾膜過濾,分析樣都經孔徑0.45 μm的濾膜過濾后進行HPLC檢測。

2 結果與分析

2.1 普洱熟茶提取液及其濃縮液上MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱經不同乙醇濃度洗脫的分離效果

圖2是普洱熟茶提取液(圖2A)及其濃縮液上MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱經10%乙醇洗脫液(圖2B)、30%乙醇洗脫液(圖2C)、50%乙醇洗脫液(圖2D)、70%乙醇洗脫液(圖2E)和90%乙醇洗脫液(圖2F)的HPLC色譜圖。從圖2可以看出,普洱熟茶提取液黃酮醇類物質的色譜峰集中分布在保留時間3～28 min的區段內,且在保留時間12～23 min的區間出現了響應值較高的8個色譜峰(圖2A,a～h);10%和30%乙醇濃度洗脫液只在保留時間為4.5 min時有1個響應值較大的色譜峰外,沒有檢測出太多的色譜峰,說明低濃度的乙醇水溶液對普洱熟茶黃酮醇類物質的洗脫效果不理想;50%洗脫液的黃酮醇類物質集中分布在保留時間10～25 min的區段內,且與普洱熟茶提取液的HPLC色譜圖比較可以看出,50%乙醇洗脫液的黃酮醇類物質組成和普洱熟茶提取液中黃酮醇類物質的組成相似,在12～19 min的區間也出現圖2中所示的響應值較高的6個(a～f)色譜峰,但保留時間在20 min以后的黃酮醇類物質沒有被洗脫出來;70%乙醇洗脫餾分的黃酮醇類物質集中分布在保留時間16～29 min的區段內,且在23 min時出現了響應值較大的1個色譜峰(g),由此推斷70%乙醇洗脫液可作為純化此黃酮醇類物質的最佳洗脫液;90%乙醇洗脫液的黃酮醇類物質集中分布在保留時間為15～38 min區段內,也在27 min時出現了響應值較大的1個色譜峰(h),由此推斷90%乙醇洗脫液也可作為純化此黃酮醇類物質的最佳洗脫液。從上述結果可以看出,MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱在分離普洱熟茶黃酮醇類物質有一定的初步分離效果。

圖2 普洱熟茶提取液及經樹脂色譜柱分離得到的不同乙醇濃度梯度洗脫液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatomap of tea extraction and different ethanol concentration by resin gel column chromatography eluting with a gradient fractions

2.2 葡聚糖凝膠SephadexTMLH-20色譜柱分離效果

為了獲得純度較高的普洱茶黃酮醇類物質,本實驗按1.2.2中圖1所示的分離純化方法對普洱茶黃酮醇類物質進行了細分離和純化。將經MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱初分獲得的70%乙醇洗脫液和90%乙醇洗脫液經減壓蒸餾去乙醇的濃縮液分別過直徑5.5 cm的葡聚糖凝膠SephadexTMLH-20色譜柱。濃縮后的70%乙醇洗脫液依次用3倍體積70%乙醇溶液、2倍體積80%乙醇溶液、2倍體積90%乙醇溶液以4～5 mL·min-1的流速洗脫,分別收集洗脫液,洗脫濃縮液過濾膜后進行HPLC檢測;濃縮后的90%乙醇洗脫液依次用2倍體積70%乙醇溶液、2倍體積80%乙醇溶液、2倍體積90%乙醇溶液以4～5 mL·min-1的流速洗脫,分別收集洗脫液,濃縮后過濾膜進行HPLC檢測。結果乙醇濃度為70%的濃縮液過葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱經2倍體積90%的乙醇溶液洗脫純化,獲得了Fr1和Fr2兩種單體物質;乙醇濃度為90%的濃縮液過葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱經3倍體積70%的乙醇溶液洗脫純化,獲得了一種單體物質Fr3。鑒于獲得的Fr1、Fr2和Fr3三種單體物質分別與楊梅素、槲皮素和山奈酚的保留時間相近,采用加標品確認的方法,在此三種物質中分別加入楊梅素、槲皮素和山奈酚的標準品,并經HPLC分析確認,Fr1與楊梅素的保留時間完全一致,且Fr1色譜峰與楊梅素的色譜峰完全重合,加入楊梅素標準品后Fr1色譜峰的響應值也相應增加(圖3),說明Fr1為楊梅素;同樣,Fr2與槲皮素的保留時間完全一致,Fr2色譜峰與槲皮素的色譜峰完全重合,且加入槲皮素標準品后Fr2色譜峰的響應值也相應增加(圖4),說明色Fr2為槲皮素;Fr3與山奈酚的保留時間完全一致,Fr3色譜峰與山奈酚的色譜峰完全重合,且加入山奈酚標準品后Fr3色譜峰的響應值也相應增加(圖5),說明Fr3為山奈酚。

圖3 楊梅素、Fr1及其加入楊梅素標準品的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatomap of myricetin,Fr1 and standard addition of myricetin

圖4 槲皮素、Fr2及其加入槲皮素標準品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatomap of quercetin,Fr2 and standard addition of quercetin

圖5 山奈酚、Fr3及其加入山奈酚標準品的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatomap of kaempferol,Fr3 and standard addition of kaempferol

從上述分離結果可知,與MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱粗分離的效果相比,葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱對普洱熟茶黃酮醇類物質的分離效果顯著。經MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱初分獲得的70%乙醇洗脫液過葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱,經90%的乙醇洗脫液洗脫純化,獲得了HPLC純度為96.0%的楊梅素和98.5%的槲皮素;MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱初分獲得的90%的洗脫液過葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱經70%的乙醇溶液洗脫純化,獲得了HPLC純度為95.6%的山奈酚。

3 結論

3.1 MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱在分離普洱熟茶黃酮醇類物質有初步分離效果,70%乙醇溶液浸提獲得的普洱熟茶提取濃縮液上MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱,經不同濃度(10%,30%,50%,70%,90%)乙醇溶液洗脫分離后,提取液中的黃酮醇類物質被分離開來,各個不同濃度的乙醇洗脫液其物質組成各不相同,10%和30%乙醇濃度洗脫液中沒有檢測到太多的色譜峰,說明低濃度的乙醇水溶液對普洱熟茶黃酮醇類物質的洗脫效果不理想(圖2B、圖2C);50%乙醇洗脫液的黃酮醇類物質組成和普洱熟茶提取液中黃酮醇類物質的組成相似(圖2D);70%和90%的乙醇洗脫液中分別在保留時間23 min和27 min時各自檢測到了響應值較大的1個色譜峰g和h(圖2E,圖2F)。

3.2 經MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱初分獲得的70%乙醇洗脫液過葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱,經90%的乙醇溶液洗脫純化,獲得了HPLC純度為96.0%的楊梅素和98.5%的槲皮素;MCI GEL CHP 20P樹脂色譜柱初分獲得的90%的洗脫液過葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱經70%的乙醇溶液洗脫純化,獲得了HPLC純度為95.6%的山奈酚。說明葡聚糖凝膠(SephadexTMLH-20)色譜柱對普洱熟茶黃酮醇類物質的分離純化效果顯著。

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Separation and purification of flavonols myricetin,quercetin and kaempferol in cooked Pu-erh tea

GUAN Wen-yu1,LI Yan-li1,LI Yan-fang1,LI Jia-wei2,SHI Yin-hua1,LI Jia-hua1,*

(1.College of Long Run Pu-erh Tea,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Lianghe County Nang song Achang Nationality Township Comprehensive Agricultural Service Center,Lianghe 679200,China)

In this paper,Yunnan cooked Pu-erh tea was used as experiment material,separation and purification of flavonols were investigated with different concentrations of ethanol as eluent by column chromatography of resin and SephadexTMLH-20,combined with high-performance liquid phase chromatography(HPLC)method,and the main flavonols were isolated and characterized. The results showed that:the extract of cooked Pu-erh tea with different concentrations(10%,30%,50%,70%,90%)of ethanol by MCI GEL CHP 20P(75～150 μm),the myricetin with the HPLC purity of 96.0% and the quercetin with the HPLC purity of 98.5% were isolated from elution 70% eluent with 90% ethanol while kaempferol with the HPLC purity of 95.6% was isolated from elution 90% eluent with 70% ethanol by SephadexTMLH-20.

cooked Pu-erh tea;flavonols;resin gel column chromatography;sephadex gel;HPLC

2014-12-30

關文玉(1989-),女,碩士,研究方向:茶葉生化,E-mail:guanwenyu1989@163.com。

*通訊作者:李家華(1970-),男,博士,教授,主要從事茶葉生化方面的研究,E-mail:jiahua1124@hotmail.com。

國家自然科學基金項目(31160173)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0060-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.003