利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育高產核酸酶P1菌株

梁劍光,顧秋憶,秦修東,陳中兵,余華順,姚 娟

(1.常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.浙江升華拜克生物股份有限公司，浙江湖州 223232；3.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 215500)

利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育高產核酸酶P1菌株

梁劍光1,2,顧秋憶1,秦修東1,陳中兵2,余華順3,姚 娟3

(1.常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.浙江升華拜克生物股份有限公司，浙江湖州 223232；3.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 215500)

為提高核酸酶P1的發酵酶活,以桔青霉菌株CK-3為出發菌株,利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變方法,獲得了3株(CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9)高產核酸酶P1菌株,其中CK-3-9突變株酶活較高,其核酸酶Pl發酵酶活達到1232 U/mL,比出發菌株CK-3(酶活866 U/mL)提高到了42.2%,遺傳實驗表明穩定性好,有望用于工業化生產。

核酸酶P1,桔青霉,ARTP,誘變

核酸酶P1(Nuclease P1,EC3.30.1),又名5′-磷酸二酯酶,是一種含鋅的金屬酶,核酸酶P1能水解RNA和熱變性DNA得到5′-核苷酸,可用于食品調味劑(呈味核苷酸)和核苷酸醫藥工業,具有廣泛的實用價值,在核苷酸工業生產中起到的重要作用[1]。1960年日本科學家發現5′-肌苷酸具有強烈鮮味首先將核苷酸類物質作為鮮味劑生產,并于上世紀60年代后日本成為核苷酸增鮮劑的最大生產國[2]。國內采用深層發酵法生產核酸酶P1的廠家幾乎沒有,導致價格被日本味之素企業壟斷,其主要原因是發酵生產菌種產酶水平低,導致生產成本居高不下,因此,如何獲得高產核酸酶P1的生產菌種是解決生產核酸酶P1的關鍵技術之一[3]。常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma ARTP)具有射流溫度低、產生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡易、成本低、與生物大分子和細胞作用明顯等優點[4-5]。ARTP放電均勻穩定、活性粒子濃度高、操作簡便、誘變快速、環境友好、對操作者安全無輻射、操作可控性強等特點,已成為一種應用廣泛的、快速高效的新型生物誘變育種方法[6]。到目前為止,ARTP 誘變育種儀已經成功應用于包括細菌、真菌、微藻在內的多種微生物,并且突變率和正突變率均較高,突變株遺傳穩定性好等諸多優點[7]。本實驗以核酸酶P1的產生菌為出發菌株,利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變篩選高產核酸酶P1菌株,從而獲得高產菌種,有望用于工業生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖,魚粉蛋白胨,蔗糖,吐溫-80,鉬酸銨,高氯酸,酵母核糖核酸RNA等實驗試劑 國藥集團。

桔青霉 出發菌種CK-3 常熟理工學院微生物與分離工程實驗室。

常壓室溫等離子體(ARTP)思清源生物科技有限公司;霉菌培養箱 MP-160B型 上海申賢設備廠;大容量恒溫培養搖床 SPH-211型 上海世平實驗設備有限公司;紫外可見分光光度計UNIKONXS型, 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 斜面和平板培養 斜面和平板培養基采用PDA培養基:馬鈴薯20%,葡萄糖2%,瓊脂粉2%,pH自然。用接種環挑取一環于無菌生理鹽水中進行稀釋(10-7),涂布于斜面或平板上,放置于28 ℃霉菌培養箱中進行培養5 d。

1.2.2 種子培養及發酵方法 采用一級種子發酵方法,具體如下:種子培養基(質量體積分數):葡萄糖3%,蛋白胨0.15%,KH2PO40.15%,K2HPO40.15%,MgSO40.24%,CaCl20.15%,pH6.5。從母瓶中挖取約1 cm2菌苔接種于250 mL三角瓶(裝液量40 mL)的液體種子培養基中,在28 ℃,轉速250 r/min,搖床培養24～26 h。

產酶基礎培養基(質量分數):蔗糖1.5%,蛋白胨0.6%,KH2PO40.05%,K2HPO40.05%,MgSO40.04%,CaCl20.08%,ZnSO40.02%,吐溫80 0.05%,pH6.5。從液體種子培養基中移取3 mL種子液到250 mL三角瓶(裝液量30 mL)的產酶基礎培養基中,28 ℃,轉速250 r/min,搖床培養66～72 h,測定發酵液酶活。

1.2.3 ARTP 誘變方法 參考文獻[8-9]進行。用10 mL無菌生理鹽水加入1支斜面孢子,震蕩1 min后菌液顏色變深,適當用無菌水稀釋成不同濃度(10-4,10-5,10-6,10-7,10-8)。用移液槍取出適量在ARTP誘變金屬片上,依照說明書操作,其主要流程如圖1[10]。在誘變過程中,大部分孢子死亡,只少部分處理后的孢子存活下來,可以用致死率來表示。因此,致死率是指經過誘變處理后,死亡的細菌或孢子與處理之前的細菌或孢子總數的比值。本實驗在測定時候,取同一份孢子懸液,分成兩份,一份經誘變處理后進行平板計數,另一份不誘變就進行平板計數,然后將兩者結果進行比較即可。具體計算公式如下:

致死率(%)=未經處理平板菌落總數-經過處理后的平板菌落總數/未經處理平板菌落總數×100

圖1 ARTP誘變基本流程圖Fig.1 The basic flow of the ARTP mutation

1.2.4 核酸酶P1測定 參考文獻[11],略有改動。在試管中加入1.9 mL底物溶液(3% 酵母核糖核酸RNA,煮沸20 min,調節pH到5.0,用pH為5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液定容),置于68 ℃水浴保溫10 min后,加入預處理好的發酵液0.1 mL,繼續保溫15 min后,置冰水中冷卻,迅速加入2.0 mL核酸沉淀劑(0.25%鉬酸銨-2.5%高氯酸),繼續冷卻10 min,于3500 r/min離心15 min,取0.2 mL上清液加雙蒸水稀釋定容至50 mL,于260 nm處測定吸光度。

空白對照:1.9 mL底物,在68 ℃保溫25 min,加入核酸沉淀劑2.0 mL,再加酶液0.1 mL,余下步驟同樣品測定。上述測酶活的條件下,每min所生成的核苷酸量在260 nm光密度為1.0時,定義為1個酶活單位。

相對酶活(U/mL)=篩選后的菌株酶活-對照菌株酶活/對照菌株酶活×100%

本文所有的酶活測定均為三個平行樣的平均值。

1.2.5 高產菌株篩選方法 初篩:菌懸液經過ARTP誘變處理后,適當稀釋涂平板,在28 ℃培養箱中培養5 d,觀察菌落孢子量和顏色并測定菌落直徑大小,選取孢子量多,菌落直徑相對較大的菌落進行搖瓶發酵驗證。復篩:在初篩菌株基礎上,對酶活較高的菌株進行在進行一輪ARPT誘變,通過搖瓶發酵,選取酶活更高的菌株。

1.2.6 突變株菌落形態變化 以CK-3菌株為出發菌株,其孢子經過ARTP處理后,稀釋涂布于PDA平板上,28 ℃培養4 d,觀察菌落形態變化。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變處理時間的選擇

桔青霉菌株孢子外壁較厚,物理處理孢子誘變時間一般在1 min以上。因此,本實驗ARTP 誘變處理時間單位為分鐘(min)。實驗結果見圖2,橫坐標表示處理時間(min),縱坐標為孢子致死率(%)。從圖2中可知,桔青霉菌株孢子在ARTP處理過程中,隨著處理時間的增加,致死率在不斷增加,當處理時間為3 min后,孢子致死率達到93.3%,超過4 min時,孢子致死率接近100%,桔青霉菌株孢子幾乎都被殺死。因此,本實驗ARPT處理桔青霉孢子時間為3～4 min即可。

表1 等離子誘變初篩突變菌株的酶活

圖2 ARPT誘變致死率曲線Fig.2 Variation of the lethality rate by ARTP with different exposure time

注:酶活為三個平行樣的平均值。

2.2 ARPT誘變高產突變株選育

2.2.1 突變株菌落形態變化 通過第一輪ARTP誘變,獲得11株相對高產的突變菌株(編號依次為CK-3-1,CK-3-2,CK-3-3,CK-3-4,CK-3-5,CK-3-6,CK-3-7,CK-3-8,CK-3-9,CK-3-10,CK-3-11)。各突變株的菌落形態圖。

根據圖3菌落形態顏色可看出菌落CK-3-1、CK-3-2、CK-3-3與CK-3-9的菌落顏色都發生了較為明顯的變化:CK-3-1與CK-3-9的菌落顏色偏深灰色且菌落直徑較大,菌落生長較為旺盛;CK-3-2與CK-3-3菌落顏色偏深灰綠色。從菌落大小上來看,大多數突變菌株的生長較出發菌株偏大,突變株培養4 d菌落直徑就達到1.5 cm,而出發菌株培養5 d左右菌落直徑才能達到1.5 cm(見表1)。從菌落顏色的變化間接證明了菌株的代謝產物發生了一定的變化,而菌落大小說明了突變株的生長速度較快。

圖3 ARPT誘變后菌落與出發菌落對比Fig.3 The comparison between CK-3 strian and the ARPT mutation strains

2.2.2 突變株發酵性能初步篩選 參照1.2.5實驗方法,在平板上挑取各突變株菌落進行菌株篩選發酵性能驗證,結果見表1。從相對酶活結果來看,共有3株突變菌株(CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9)獲得相對酶活7%以上的提高,分別為107.4%,114.3%和116.4%。11株突變株的菌落形態顏色變化較大,CK-3-1和CK-3-9均為深灰色,說明深灰色菌落可能孢子量較多,酶活相對較高,將3株突變株保存,進行下一步實驗。

2.2.3 高產突變株發酵復篩 在初篩突變菌株CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9基礎上,對3株突變菌進一步發酵復篩,實驗條件和培養基與 出發菌株相同,進行搖瓶發酵復篩。在實驗過程中,因CK-3-9最為明顯,以CK-3-9 與出發菌株對照比較為例,發現桔青霉突變株種子液菌球形態和發酵菌球形態和顏色存在較大差異,結果見圖4。

圖4 出發菌株CK-3與突變株CK-3-9發酵過程菌形比較Fig.4 The mycelial morphology comparison between the original CK-3 strian and the ARPT mutation strain CK-3-9

經過圖4可以看出突變株CK-3-9種子瓶中的菌球細膩,菌球小、菌球量多,種子液清澈,顏色淺;而出發菌株CK-3種子瓶的菌絲球大、菌球量少,顏色淡黃、菌液清澈。通過發酵液酶活測定,3株突變菌的發酵酶活結果見表2。

表2 等離子誘變后突變菌株的酶活

最終結果表明,以核酸酶Pl產生菌桔青霉CK-3作為出發菌株,經過常壓室溫等離子體誘變處理,得到了3株高產核酸酶P1突變株,經發酵復篩驗證,其中CK-3-9產生的核酸酶Pl酶活提高到1232 U/mL,比原始出發菌株CK-3(866 U/mL)提高了42.3%,該菌株在安琪酵母有限公司進行中試生產,達到了工業化要求。

2.2.4 突變株遺傳穩定性考察 對上述的3株高產核酸酶P1突變菌進行發酵穩定性考察,其結果如圖5所示。

圖5 高產突變株遺傳穩定性考察 Fig.5 Genetic stability of the high-yielding strain

從圖5中可以看出,CK-3-1、CK-3-7和CK-3-9的菌株隨著傳代次數在3代以內酶活程增加趨勢,隨著傳代次數增加到第4和第5代,其產核酸酶P1的酶活均有不同程度的降低,但總的來看,3株高產菌株的酶活沒有大起大落,均較穩定。核酸酶P1酶活在第2和3代有所升高可能是因為隨著傳代次數的增加,突變菌逐漸適應了外界的環境,其新陳代謝逐漸調整到最佳狀態。經過高產核酸酶P1遺傳穩定性考察,CK-3-9的酶活穩定在1200 U/mL左右,這樣我們就得到了ARTP誘變后產核酸酶P1酶活高的桔青霉菌株,接近于工業化生產菌株。

3 結論

本文首次利用ARTP 誘變桔青霉菌株,成功獲得了3株高產核酸酶P1突變株,其中CK-3-9產生的核酸酶Pl酶活高達1232 U/mL,其遺傳穩定性好,為工業化生產核酸酶P1提供了較好菌株和菌種育種科學依據。

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Screening of high-yield nuclease P1 strain by exposed under atmospheric and room temperature plasma

LIANG Jian-guang1,2,GU Qiu-yi1,QIN Xiu-dong1,CHEN Zhong-bing2,YU Hua-shun3,YAO Juan3

(1.School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China;2. Zhe Jiang Shenghua Biok Biology Co. Ltd,Huzhou 313220,China;3. Angel Yeast Co.Ltd.,Yichang 443003,China)

To enhance the productivity of nuclease P1 fromPenicilliumcitrinum,a novel mutation system with atmospheric and room temperature plasma(ARTP)was used. Experiment results indicated that the high-yield nuclease P1 strains(CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9)was obtained,and the CK-3-9 nuclease P1 enzyme activity reached 1232 U/mL,which was increased by 42.2% compared with the parent strain CK-3. The result showed that the genetic stability was good.

Nuclease P1;penicilliumcitrinum;ARTP;mutation

2015-01-26

梁劍光(1979-)，男，博士研究生，副教授，研究方向：微生物及發酵工程，E-mail:liang4523@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0183-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.029