固定化蚯蚓纖溶酶熱穩定性及熱失活動力學研究

雷敬玲,趙鐘興,王朝陽,朱長姐,馮麗錦,盧強基

(廣西大學化學化工學院,廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室,廣西理工科學實驗中心,廣西南寧 530004)

固定化蚯蚓纖溶酶熱穩定性及熱失活動力學研究

雷敬玲,趙鐘興*,王朝陽,朱長姐,馮麗錦,盧強基

(廣西大學化學化工學院,廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室,廣西理工科學實驗中心,廣西南寧 530004)

通過纖維蛋白平板法測定蚯蚓纖溶酶在不同溫度下的酶活力,對固定化和游離蚯蚓纖溶酶的熱失活動力學進行初步分析。實驗表明:隨溫度升高固定化和游離蚯蚓纖溶酶活性減小趨勢逐漸增大,酶失活速率加快。當溫度超過60 ℃時,兩者失活現象明顯,但固定化蚯蚓纖溶酶的熱穩定性明顯優于游離酶。動力學分析表明,在30～60 ℃范圍內,固定化和游離蚯蚓纖溶酶熱失活的表觀活化能分別為130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1。

蚯蚓纖溶酶,固定化酶,熱穩定性,動力學

蚯蚓又稱地龍,性寒,味微咸,在醫學上用途廣泛,具有清熱平肝、利尿、解痙、通經、活血化瘀等作用,主治熱病驚狂喘咳、急慢驚風,半身不遂、小便不通等,是我國重要的中藥材之一[1]。1991年日本學者原恒教授從蚯蚓體內提取到蚯蚓纖溶酶(Earthworm Fibrinolytic Enzyme,EFEs)[2],又名蚓激酶,該酶既具有纖溶酶活性和纖溶酶原激活活性,又能溶解陳舊血栓和抑制新血栓形成,有抗凝溶血栓[3-4]、抗炎[5]、抗癌抗腫瘤[6-8]、降血脂[9]等作用,已有蚓激酶膠囊、蚓激酶腸溶片、溶栓膠囊等藥物投入市場。目前國內外許多研究學者已從藥理學[10]、組分純化[11]、酶學性質[12]、生化性質[13]、抗原性[14]、結構和克隆表達[15-17]等方面對蚯蚓纖溶酶進行研究,但是這些研究大都以游離酶為基礎,對固定化酶酶動力學的研究鮮有報道。固定化酶操作穩定性好,重復利用率高,本文將蚯蚓纖溶酶固定在實驗室自制的磁性殼聚糖微球上,對固定化后的蚯蚓纖溶酶與游離酶進行熱失活動力學研究,并計算相關動力學和熱力學常數,為固定化蚯蚓纖溶酶的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蚯蚓(品種為赤子愛勝蚓) 購買于桂林和記低碳農業科技有限公司;尿激酶(酶活500 U·mg-1)、牛凝血酶(2000 U·mg-1) 中國藥品檢定所;牛纖維蛋白原(蛋白含量65%～85%) 美國SIMGA公司;瓊脂糖(凝膠強度(1%)≥750 g r·cm-2) 西班牙GENE公司;共沉淀法制備磁性殼聚糖微球,主要成分為殼聚糖、四氧化三鐵;其他藥品均為分析純。

Merlin Compact型掃描電鏡 德國卡爾蔡司有限公司;AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器有限公司;Allegra25R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;510pH計 新加坡熱電有限公司;HH-B11型電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磁性殼聚糖微球的制備及表征

1.2.1.1 磁性殼聚糖微球的制備 將Fe3O4分散于殼聚糖醋酸溶液并加至含有Span-80的液體石蠟中,40 ℃攪拌乳化形成微乳體系,加入戊二醛交聯,調節pH至10左右,繼續反應1 h,產物洗凈,磁鐵分離,即可得到磁性殼聚糖微球。

1.2.1.2 磁性殼聚糖微球的表征 采用KBr壓片法,將磁性殼聚糖微球在波長4000-1～500 cm-1處進行紅外光譜掃描;用Merlin Compact型掃描電鏡掃描觀測磁性殼聚糖微球的形貌特征。

1.2.2 蚯蚓纖溶酶活性的測定

1.2.2.1 尿激酶標準曲線的制作 采用纖維蛋白平板法[18],5 mL 10 mg·mL-1纖維蛋白原溶液和1 mL 20 U·mL-1凝血酶加入到2%瓊脂糖溶液中搖勻,倒入培養皿中室溫靜置30 min后打孔。每孔進樣10 μL,37 ℃培養18 h測溶圈面積,以不同酶活單位尿激酶的溶圈面積與單位酶活做標準曲線。

1.2.2.2 蚯蚓纖溶酶活性測定 游離酶活性測定方法與1.2.2.1方法相同,測溶圈面積后根據尿激酶標準曲線計算游離酶活性;固定化酶酶活測定是往每孔中加入30 mg固定化酶微球,其它步驟同上。

1.2.3 固定化蚯蚓纖溶酶制備 固定化蚯蚓纖溶酶制備:將從新鮮大豆中提取得到的大豆胰蛋白酶抑制劑溶于pH7.0檸檬酸緩沖液并加入磁性殼聚糖微球,35 ℃水浴振蕩偶聯后得到偶聯大豆胰蛋白酶抑制劑的磁性殼聚糖微球。再按照李菁華[19]實驗方法提取得到的蚯蚓纖溶酶粗酶液(測定酶活為10 kU·mL-1)按20∶1的比例添加至上述磁性殼聚糖微球中,30 ℃恒溫水浴振蕩3 h后洗滌,磁鐵分離收集即可得到固定化蚯蚓纖溶酶(測定酶活為160 U·mg-1),置于4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.4 蚯蚓纖溶酶熱失活測定 將按實驗方法1.2.3得到的固定化和游離蚯蚓纖溶酶在30、40、50、55、60 ℃下水浴,在0、20、40、60、80、100、120 min時取樣,根據1.2.2.2實驗方法測定酶活,計算殘余酶活比q。

式(1)

式中:c0-不同溫度下0 min時酶活,U;ct-t min時酶活,U。

1.2.5 蚯蚓纖溶酶熱失活動力學參數的測定 在酶濃度較低時,酶失活主要為熱失活現象,并服從一級失活規律,其失活速率用k表示。

式(2)

通過對溫度與酶失活影響的研究,蚯蚓纖溶酶的失活速率為:

式(3)

式中:k-酶失活速率常數,min-1,且服從阿倫尼烏斯公式k=k0e-Ea/RT;

對式(3)進行積分求對數得式(4):

lnq=-kt

式(4)

式中:t-酶失活時間,min。

進一步算出這兩種酶的半衰期t1/2、ΔH、ΔS、ΔG,計算公式如下:

式(5)

ΔH=Ea-RT

式(6)

式(7)

ΔG=-RT+ΔH

式(8)

式中:t1/2為半衰期,min;Ea為熱力學反應活化能,kJ·mol-1;R為氣體常數,8.314J·K-1·mol-1;ΔH為焓變,kJ·mol-1;ΔS為熵變,J·K-1·mol-1;ΔG為吉布斯自由焓,kJ·mol-1;H為普朗克常數,1.104×10-35J·min;Kb為玻爾茲曼常數,1.381×10-23J·K-1。

2 結果與分析

2.1 磁性殼聚糖微球的表征

2.1.1 磁性殼聚糖微球紅外光譜分析(FT-IR) 磁性殼聚糖微球FT-IR表征如圖1所示。圖1a中3415 cm-1是N-H和O-H的伸縮振動峰,1617 cm-1是酰胺的特征吸收峰,1431 cm-1是-CH3的特征振動峰,1119 cm-1是C-O的伸縮振動吸收峰,b中620 cm-1處出現了Fe3O4的特征吸收峰,圖c中不僅保留了殼聚糖原有的特征峰,且在620 cm-1出現了Fe3O4的Fe-O特征吸收峰,說明制備的磁性殼聚糖微球中包含了Fe3O4和殼聚糖。

圖1 磁性殼聚糖微球紅外光譜圖Fig.1 FT-IR of magnetic chitosan nanoparticles注:a、b、c分別為殼聚糖、磁性Fe3O4納米粒子和磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖。

2.1.2 磁性殼聚糖微球掃描電鏡分析(SEM) 磁性殼聚糖微球SEM表征如圖2所示。圖2a為放大125000倍的電鏡圖,圖2b為放大5000倍的電鏡圖。由圖2a可知,殼聚糖與Fe3O4納米粒子形成的復合微粒粒徑介于100～300 nm之間,該粒徑利于微球在反應體系中分散和磁分離,且小粒徑的微球具有更大的比表面積,可以共價結合更多的酶,同時也可以降低底物和產物擴散限制的影響。由圖2b可知,磁性殼聚糖微球的粒徑分布均勻,分散性較好。

圖2 磁性殼聚糖微球電鏡圖Fig.2 SEM of magnetic chitosan nanoparticles注:a:放大125000倍,b:放大5000倍。

2.2 蚯蚓纖溶酶熱失活動力學測定

2.2.1 尿激酶標準曲線 根據1.2.2.1實驗方法得到尿激酶標準曲線方程:Y=0.7517X+211.36,R2=0.9944,線性范圍為15.5～248 U·mL-1。

2.2.2 蚯蚓纖溶酶熱失活測定 根據步驟1.2.4得固定化和游離蚯蚓纖溶酶相對酶活隨時間關系如圖3所示。由圖可知,溫度對固定化和游離蚯蚓纖溶酶影響較大,隨溫度的增大兩者相對酶活性減小趨勢逐漸增大。當溫度達到60 ℃時酶失活現象嚴重,在60 min內相對酶活急劇下降,60 min后下降趨勢穩定。在30 ℃和40 ℃時相對酶活隨時間變化很小,50 ℃以上酶失活現象逐漸明顯,但是在相同溫度條件下,圖3b中固定化蚯蚓纖溶酶的相對活性比圖3a中游離蚯蚓纖溶酶的相對活性高,說明經磁性殼聚糖微球固定化后的蚯蚓纖溶酶比游離態的蚯蚓纖溶酶熱穩定性好。

圖3 游離酶和固定化蚯蚓纖溶酶不同溫度相對酶活隨時間變化曲線Fig.3 The relative activity of free and immobilized earthworm fibrinolytic enzyme at different temperature注:a:游離酶,b：固定化酶,圖4、圖5同。

2.2.3 蚯蚓纖溶酶熱失活動力學參數的測定 將圖3中的實驗數據代入到步驟1.2.5酶失活動力學方程式(4)中,得到不同溫度下lnq與時間t的關系如圖4所示。由圖可知,從30 ℃到60 ℃,酶活力受溫度影響逐漸升高。在30 ℃和40 ℃時酶幾乎不失活,隨著溫度升高酶失活現象越來越明顯,所以溫度對固定化和游離蚯蚓纖溶酶的活性具有顯著的影響。

圖4 固定化和游離蚯蚓纖溶酶lnq與時間關系圖Fig.4 The curves of lnq for free enzyme and immobilized earthworm fibrinolytic enzyme and time

根據式(4)計算得到lnk與T-1關系如圖5所示。

表1 游離酶失活動力學及熱力學常數

表2 固定化酶失活動力學及熱力學常數

圖5 固定化和游離蚯蚓纖溶酶lnk與溫度-1關系曲線Fig.5 The curves of lnk for free enzyme and immobilized earthworm fibrinolytic enzyme and T-1

根據圖5數據可得固定化和游離蚯蚓纖溶酶失活速率常數和溫度關系為:

lnk=-14031/T+38.87(游離酶)

式(9)

lnk=-15688/T+43.39(固定化酶)

式(10)

從式(9)和式(10)可計算得到固定化和游離蚯蚓纖溶酶的酶失活反應活化能分別為130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1,根據步驟1.2.5式(5)～式(8)算出這兩種酶的半衰期,t1/2、ΔH、ΔS、ΔG如表1和表2所示。

根據表1和表2固定化和游離蚯蚓纖溶酶失活動力學及熱力學常數可知,隨溫度的升高,失活速率常數k增加趨勢明顯。但是相同溫度下固定化酶失活速率比游離酶小,說明溫度對固定化酶的影響小于對游離酶的影響,經磁性殼聚糖微球固定化后的蚯蚓纖溶酶的熱穩定性更好。

3 結論

本研究提取蚯蚓纖溶酶和大豆胰蛋白酶抑制劑,并和磁性殼聚糖微球偶聯得到偶聯大豆胰蛋白酶抑制劑的磁性殼聚糖微球固定化蚯蚓纖溶酶。通過對磁性殼聚糖微球的表征發現磁性殼聚糖微球粒徑分布均勻,成功包裹Fe3O4納米粒子。再通過比較固定化和游離蚯蚓纖溶酶在不同溫度下的熱穩定性發現隨著溫度升高,固定化和游離蚯蚓纖溶酶失活速率加快,但是經磁性殼聚糖微球固定化后的蚯蚓纖溶酶對溫度的敏感性要低于游離酶熱穩定性更好。動力學分析表明,固定化和游離蚯蚓纖溶酶的表觀活化能分別為130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1。

[1]孫秀英,王富珍,王福星. 中藥地龍研究進展[J]. 中國中醫藥信息雜志,2009,16(S1):102-105.

[2]Mihara H,Sumi H,Yoneta T,et al. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm,Lumbricus rubellus.[J]. The Japanese Journal of Physiology,1991,41(3):461-472.

[3]Li G,Wang K Y,Li D,et al. Cloning,expression and characterization of a gene from earthworm Eisenia fetida encoding a blood-clot dissolving protein[J]. Plos one,2012,7(12):e53110.

[4]楊志興,楊學成,張云湖,等. 赤愛勝蚯蚓(Eisenia Foetida Sarigny)纖溶酶的研究Ⅱ藥理學作用[J]. 生物技術,1992,2(1):15-18.

[5]Kohlerova P,Beschin A,Silerova M,et al. Effect of experimental microbial challenge on the expression of defense molecules in Eisenia foetida earthworm[J]. Developmental and comparative immunology,2004,28(7-8):701-711.

[6]李洪燕,劉悅,張福榮,等. 蚯蚓纖溶酶的抗腫瘤作用[J]. 中國藥理學通報,2004,20(8):908-910.

[7]王娟,陳洪,季紅,等. 蚯蚓纖溶酶對裸鼠人肝癌細胞移植瘤生長及CD44v6表達的影響[J]. 腫瘤防治研究,2009,36(5):375-379.

[8]陳洪,余艷秋,黃錦,等. 蚯蚓纖溶酶降低胃癌細胞與血管內皮細胞粘附性及CD44v6表達[J]. 中華消化雜志,2007(10):682-684.

[9]潘洪,楊思進,晏新,等. 蚓激酶對高脂血癥患者血脂及血液流變學的影響[J]. 首都醫藥,2008(6):38.

[10]姜東勝,劉復強,趙相印,等. 赤子愛勝蚓纖溶酶對大鼠血小板聚集性的藥理作用觀察[J]. 首都醫學院學報,1994,15(4):291-294.

[11]Iannucci N,Camperi S,Cascone O. Purification of lumbrokinase from Eisenia fetida using aqueous two-phase systems and anion-exchange chromatography[J]. Separation and purification technology,2008,64(1):131-134.

[12]王雪英,伍曉斌,徐鳳彩. 蚯蚓纖溶酶的分離純化及其部分酶學性質的研究[J]. 藥物生物技術,2003,10(2):88-91.

[13]李莉,劉艷玲,吳紅艷,等. 蚯蚓纖溶酶分離及部分生化性質的研究[J]. 中醫藥學刊,2001,19(3):283-284.

[14]趙曉瑜,侯艷,高珊,等. 蚯蚓纖溶酶組分的抗原性分析[J]. 中國生物化學與分子生物學報,2007,23(2):147-153.

[15]Sharma A,Sonah H,Deshmukh R K,et al. Cloning of fibrinolytic protease-0(Efp-0)gene from diverse earthworm individuals[J]. Indian journal of biotechnology,2011,10(3):270-273.

[16]Li D,Tong W,Yang Y. Functional expression of an earthworm fibrinolytic enzyme in Escherichia coli[J]. World journal of microbiology & biotechnology,2008,24(5):613-618.

[17]Dong G Q,Yuan X L,Shan Y J,et al. Molecular cloning and characterization of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from earthworm Eisenia foetida[J]. Acta biochimica et biophysica sinica,2004,36(4):303-308.

[18]Astrup T,Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity[J]. Archives of biochemistry and biophysics,1952,40(2):346-351.

[19]李菁華,趙偉.蚯蚓纖溶酶的分離純化研究[J].中國生化藥物雜志,2005,26(5):288-291.

Study on thermal stability and thermal inactivation kinetics of immobilized earthworm fibrinolytic enzyme

LEI Jing-ling,ZHAO Zhong-xing*,WANG Chao-yang,ZHU Chang-jie,FENG Li-jin,LU Qiang-ji

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University,Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of New Chemical Application Technology in Resources,Guangxi Institute of Science Experimental Center,Nanning 530004,China)

The thermal stability of immobilized and free enzyme were investigated by determining enzyme activity at different temperatures by fibrin plate method,and the thermal inactivation kinetic of immobilized and free earthworm fibrinolytic enzyme was analyzed. The results showed that the relative activity of immobilized and free earthworm fibrinolytic enzyme was gradually decreased and the rate of enzymes rapidly was inactivated with the increasing of temperature,both the activity of free and immobilized enzyme were decreased seriously when the temprature was up to 60 ℃,but the latter showed better thermal stability. Enzymatic kinetics analysis indicated that the apparent activation energy of immobilized and free earthworm fibrinolytic enzyme were 130.43 kJ·mol-1and 116.65 kJ·mol-1respectively between 30 ℃ and 60 ℃。

earthworm fibrinolytic enzyme;immobilized enzyme;thermal stability;kinetic

2015-02-09

雷敬玲(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：leijingling0524@163.com。

*通訊作者:趙鐘興(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工，E-mail：zzxx@gxu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31401629)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.013