地榆多酚分離純化及其抗氧化性研究

毛迪銳,姜貴全,張詩朦,孫繼偉,曹佳碩

(北華大學林學院,吉林吉林 132013)

地榆多酚分離純化及其抗氧化性研究

毛迪銳,姜貴全*,張詩朦,孫繼偉,曹佳碩

(北華大學林學院,吉林吉林 132013)

通過比較 7 種大孔樹脂對地榆多酚的吸附率和解吸率的影響,篩選出 XAD-8 樹脂適宜分離地榆多酚。地榆多酚分離純化的條件為:上樣濃度 2.5 mg/mL,pH5.0,平衡吸附時間 3 h,洗脫液乙醇體積分數 60%,上樣流速 1.0 mL/min,洗脫流速 1.5 mL/min,純化后地榆多酚純度由 20.79%提高到 62.97%。地榆多酚具有較強的抗氧化能力,清除羥自由基和還原能力均高于VC,地榆多酚對羥自由基和DPPH自由基的半抑制質量濃度(IC50)分別為0.179 mg/mL和 0.691 mg/mL。

地榆,多酚,純化,抗氧化

地榆(Sanguisorbaofficinalis)是薔薇科地榆屬的多年生草本植物。地榆主要分布在灌叢、山坡、草地、草原、草甸及疏林下。地榆中含有多種藥用化學成分,主要包括鞣質、三萜皂苷、黃酮、蒽醌[1]等;具有止血、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、消炎等多種藥理作用[2]。地榆藥用部位為根部,所以主要研究其根部所含有的活性成分。毛迪銳等文獻[3]報道,地榆根中含有豐富的多酚類物質。植物多酚是具有多羥基結構的植物體主要次生代謝物,具有抗氧化、抑制癌變、抗過敏、抗輻射等多種功效。多酚粗提取物分離純化的主要方法有大孔樹脂吸附法[4]、沉淀分離法[5]、層析分離法[6]、HPLC半制備色譜[7]、高效逆流色譜[8]等。大孔吸附樹脂是一種具有三維立體空間的有機高分子聚合物,在植物多酚的分離純化中被廣泛應用[9-11]。

目前,國內對地榆多酚的分離純化和抗氧化能力研究未見報道。因此,本實驗選取了 7 種大孔樹脂,通過比較吸附率和解吸率,篩選出適宜分離地榆多酚的樹脂,并對地榆多酚的分離純化工藝進行優化,研究其抗氧化能力,為合理開發利用地榆多酚提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地榆 采于吉林市二道林場，根洗凈、風干、粉碎,過40目篩分器,備用。

HP20大孔樹脂 三菱化學公司;XAD7HP、XAD1600大孔樹脂 北京慧德易科技有限責任公司;XAD-8、LSA-10大孔樹脂 西安藍曉科技新材料股份有限公司;HB1600大孔樹脂 上海旻永實業有限公司;D001大孔樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司;沒食子酸標準品 美國Sigma公司;其他試劑 均為國產分析純。

SE202F電子分析天平 奧豪斯上海公司;JY92-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;LG10-2.4A高速離心機 北京醫用離心機廠;RE52CS-1旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;JH722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;HZQ-C空氣浴振蕩器 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地榆多酚提取液的制備 稱取地榆根粗粉100 g,加入2000 mL 60%乙醇,在超聲功率330 W的條件下提取20 min,超聲提取2次,合并濾液,離心分離(6000 r/min,15 min),取上清液于旋轉蒸發器中濃縮,除掉乙醇,濃縮液備用。

1.2.2 地榆多酚濃度的測定 采用參照國標(GB/T 8313-2008)方法中的Folin-Ciocalteu法,測定多酚含量。根據標準曲線計算地榆多酚濃度。

1.2.3 大孔樹脂的預處理 稱取7種不同極性的大孔樹脂各10 g,用95%乙醇浸泡24 h,使其充分溶脹,用蒸餾水洗至無醇味;再用1 mol/L的鹽酸溶液浸泡24 h,用蒸餾水洗至中性;最后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡24 h,用蒸餾水洗至中性,備用。

1.2.4 篩選大孔樹脂 準確稱取預處理后經濾紙吸干的大孔樹脂2.0 g,置于100 mL三角瓶中,加入40 mL濃度為2.5 mg/mL的地榆多酚溶液,恒溫(30 ℃)水浴振蕩器中(100 r/min)振蕩吸附24 h,抽濾,測上清液的吸光度值,按公式(1)、式(2)計算吸附率和吸附量。將充分吸附后的大孔樹脂,用蒸餾水洗凈表面殘留的多酚溶液,置于100 mL三角瓶中,各加入40 mL 60%的乙醇溶液進行解吸。在相同條件下恒溫振蕩解吸24 h,抽濾,測定吸光度,按公式(3)計算解吸率。根據吸附率和解吸率,優選出適合地榆多酚分離純化的大孔樹脂。

式(1)

式(2)

式(3)

式中:A為吸附率(%);Q為吸附量(mg/g);D為解吸率(%);C0為溶液初始多酚濃度(mg/mL);C1為吸附后溶液剩余多酚濃度(mg/mL);C2為解吸液中多酚的濃度(mg/mL);V1為吸附液體積(mL);V2為解吸液體積(mL);M為干樹脂質量(g)。

1.2.5 大孔樹脂靜態吸附動力學曲線的繪制 分別稱取篩選出的大孔樹脂2.0g,置于100mL三角瓶中,加入40mL濃度為2.5mg/mL的地榆多酚溶液,按照1.2.4的方法,靜態吸附,每隔1h取出一個樣品,抽濾,測定吸光度,計算吸附量,繪制靜態吸附動力學曲線。

1.2.6 地榆多酚分離純化條件的優化

1.2.6.1 多酚質量濃度對吸附量的影響 準確稱取篩選的樹脂 2.0g加入100mL三角瓶中,分別量取40mL質量濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL的地榆多酚溶液,恒溫振蕩,抽濾收集吸附液,測定吸光度值,計算吸附量,確定適宜的上樣多酚質量濃度。

1.2.6.2 多酚溶液pH對吸附量的影響 將地榆多酚溶液用鹽酸-檸檬酸二鈉緩沖溶液和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液分別調節pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。準確稱取大孔樹脂2.0g,分別置于100mL三角瓶中,加入濃度為2.5mg/mL的不同pH的地榆多酚溶液40mL,振蕩吸附8h,達到吸附飽和,抽濾收集吸附液,測定吸光度,計算吸附量,確定適宜上樣多酚溶液pH。

1.2.6.3 洗脫液乙醇體積分數對解吸率的影響 稱取充分吸附后的大孔樹脂2.0g,置于100mL三角瓶中,分別加入體積分數為20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液40mL,在30 ℃、100r/min的恒溫振蕩器中解吸振蕩8h。抽濾,收集解吸液,測定解吸液的吸光度,計算解吸率,確定適宜的洗脫液乙醇的體積分數。

1.2.6.4 上樣流速對洗脫液中多酚質量濃度的影響 稱取 4份預處理過的大孔樹脂,分別濕法裝入層析柱中(1.5cm×30cm),將地榆多酚提取液(按照1.2.6.1和1.2.6.2的結果調整濃度和pH),按照0.5、1.0、1.5、2.0mL/min的上樣流速進行動態吸附,分步收集過柱液,測定各管的多酚吸光度值,計算多酚濃度,確定到達泄露點時的流出液體積(泄露點為流出液中多酚濃度為上樣液濃度的1/10)。從而考察上樣流速對洗脫液中多酚質量濃度的影響。

1.2.6.5 洗脫流速對樹脂解吸率的影響 將吸附飽和的樹脂分別濕法裝入層析柱中(1.5cm×30cm),將洗脫液乙醇分別按照0.5、1.0、1.5、2.0mL/min的洗脫流速進行洗脫。通過計算解吸率,確定適宜的洗脫流速。

1.2.7 地榆多酚純度 將上樣液和解吸液分別蒸發濃縮,凍干6h。準確稱量凍干粉質量,并稱取0.01g定容于10mL容量瓶,測吸光度,按公式(4)計算純化前后的純度。

多酚純度(%)=多酚質量濃度×溶液體積/凍干粉質量×100

式(4)

1.2.8 地榆多酚抗氧化能力的研究

1.2.8.1 羥自由基清除能力的測定 根據文獻[12]的方法測定地榆多酚羥自由基清除能力。將純化后的地榆多酚配制成不同濃度的溶液,各取2mL加入具塞試管中,加入6mmol/L的FeSO4溶液2mL,搖勻,再加入6mmol/L水楊酸溶液2mL,搖勻,最后加入6mmol/L過氧化氫溶液2mL,在37 ℃水浴鍋中反應30min,于510nm處測吸光度。按照公式(5)計算羥自由基清除率。VC為對照。

式(5)

式中:A0為未加入樣品的溶液的吸光度值;A1為加入樣品和H2O2溶液的吸光度值;A2為未加入H2O2溶液的吸光度值。

1.2.8.2 DPPH自由基清除能力的測定 參考Brand Williams[13]和古紹彬[14]的方法略作修改。準確配制質量濃度為2.5×10-2mg/mL的DPPH標準溶液。分別取0、2、4、6、8、10 mL標準溶液用乙醇定容至10 mL,分別在515 nm波長處的吸光度值,制作標準曲線。

以無水乙醇為溶劑,配制不同濃度的地榆多酚溶液,分別取0.2 mL樣液,加入7.8 mL質量濃度為2.5×10-2mg/mL的DPPH標準液,以乙醇代替樣液為空白?；旌先芤簱u勻,在515 nm波長處,測定其在不同時間的吸光度值,根據標準曲線計算DPPH的質量濃度,按照公式(6)計算清除率。

清除率(%)=(1-反應30 min時DPPH的濃度/DPPH起始濃度)×100

式(6)

1.2.8.3 還原能力的測定 地榆多酚還原能力的測定根據陳海光等[15]方法,取不同濃度的純化后的樣品溶液各0.5 mL,加入0.2 mo1/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,混勻后置50 ℃水浴中反應20 min,然后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL,混合后離心分離(6000 r/min,8 min)。取上清液和蒸餾水各2.5 mL,加入1 mL 0.1%三氯化鐵溶液混合均勻,靜置10 min后,以試劑作空白調零,在700 nm波長處測定吸光度,吸光度增加,表明還原能力增加。以VC做對照。

1.3 數據統計與分析

每次均進行3次平行實驗,結果取平均值。實驗數據用SPSS 12.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度Y為縱坐標,沒食子酸溶液質量濃度X(μg/mL)為橫坐標,得回歸方程為:Y=0.01X+0.0409,R2=0.9952,表明沒食子酸在10～100 μg/mL范圍內濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.2 大孔樹脂的篩選

7種大孔樹脂對地榆多酚的靜態吸附實驗結果見圖1。由圖1可以看出,各種大孔樹脂對地榆多酚的吸附、解吸效果不同。從吸附效果看,吸附率較高的為XAD-8和XAD7HP大孔樹脂,吸附率分別為85.79%、84.45%。從解吸角度看,解吸率較高的為XAD-8和HP20,解吸率分別為96.58%、83.56%。綜合考慮吸附率與解吸率,XAD-8大孔樹脂不僅具有較強的吸附能力,而且解吸率也較高,因此選取XAD-8作為分離地榆多酚的大孔樹脂。

圖1 7種大孔樹脂對地榆多酚的吸附率與解吸率Fig.1 Adsorption and desorption rate of 7 resins for polyphenols from Sanguisorba officinalis

2.3 大孔樹脂靜態吸附動力學曲線

大孔樹脂靜態吸附動力學曲線見圖2。由圖2可知,隨著吸附時間的增加,大孔樹脂對地榆多酚的吸附量也隨之增大,在3 h時,已經基本達到吸附平衡,時間繼續增加時,吸附量變化不大,因此,XAD-8樹脂對地榆多酚的吸附平衡時間為3 h。

圖2 XAD-8 樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.2 Kinetic curves of static adsorption of XAD-8 macroporous resins

2.4 地榆多酚分離純化條件的優化

2.4.1 多酚溶液質量濃度對吸附量的影響 從圖3中可以看出,在低濃度條件下,隨著上樣液濃度的增大,可吸附物質也隨之增加,當上樣液濃度達到2.5 mg/mL時,吸附量最大,繼續增大上樣液的濃度,吸附量反而下降。這是因為根據吸附平衡理論,濃度太高時,容易發生多層吸附,堵塞微孔,降低內孔利用率,導致吸附量降低[16]。因此多酚質量濃度為2.5 mg/mL較合適。

圖3 上樣濃度對吸附量的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption quantity

2.4.2 多酚溶液pH對吸附量的影響 由圖4可以看出,隨著pH的升高,XAD-8大孔樹脂對地榆多酚的吸附量也不斷增大,當pH達到5.0時,吸附量最大,達到46.32 mg/g。當pH繼續升高時,吸附量反而下降。原因可能是多酚類化合物具有較多的羥基,容易電離出羥基上的H+,使水溶液呈弱酸性,而在酸性條件下,不易發生H+的電離,從而保證了多酚以分子的形式存在,利于吸附。故選擇多酚溶液pH為5.0左右為宜。

圖4 pH對吸附量的影響Fig.4 Effect of pH value on the adsorption quantity

2.4.3 洗脫液乙醇體積分數對解吸率的影響 由圖5可以看出乙醇體積分數對地榆多酚解吸率有較大的影響,隨著乙醇體積分數的增大,解吸率也隨之升高,當乙醇體積分數為60% 時,解吸率最大,為95.14%;但繼續增加乙醇的體積分數時,解吸率反而略有下降。分析原因:多酚是一類極性化合物,隨著乙醇體積分數的增加,溶劑的極性發生了改變,使得被吸附的多酚不易被洗脫下來。所以,選用體積分數60%乙醇溶液作為地榆多酚的洗脫液。

圖5 乙醇體積分數對解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption rate

2.4.4 上樣流速對洗脫液多酚質量濃度的影響 從圖6可知,上樣流速不同,出現漏點所需要的洗脫體積也不相同,分別為170,150,100,80 mL附近。這是因為流速的變化會影響溶質向樹脂內表面的擴散,從而影響吸附效果。從圖6中可以看出,上樣流速過快,多酚與樹脂還未來得及充分接觸發生吸附,便很快通過層析柱而流出柱外,所以出現泄露點較快;上樣流速為0.5 mL/min時,出現泄露點的時間較晚,操作時間長,降低分離效率;綜合實際生產考慮,選用1.0 mL/min的流速進行上樣。

圖6 上樣流速對洗脫液多酚質量濃度的影響Fig.6 Effect of sample flowing rate of eluent concentration of polyphenols

2.4.5 洗脫流速對樹脂解吸率的影響 如圖7所示,當洗脫流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min時,解吸率分別為56.06%、71.81%、79.52%、65.59%,洗脫流速為1.5 mL/min時解吸率最高,故洗脫流速為1.5 mL/min最佳。

圖7 洗脫流速對解吸率的影響Fig.7 Effect of elution speed on desorption rate

2.5 地榆多酚純度

地榆多酚經XAD-8樹脂純化后,多酚純度從20.79%±0.71%提高到62.97%±1.24%,純度提高3.0倍左右。

2.6 地榆多酚抗氧化能力的研究

2.6.1 羥自由基清除能力的測定 由圖8可知,在低濃度時,VC的清除能力高于多酚,當濃度大于0.25 mg/mL時,地榆多酚的清除能力超過VC,在濃度為1.0 mg/mL時,清除率達到87.8%。地榆多酚具有較強的清除羥自由基的能力,羥自由基的半抑制質量濃度(IC50)為0.179 mg/mL。

圖8 地榆多酚清除羥自由基的能力Fig.8 Scavenging hydroxyl free radical capacity of Sanguisorba officinalis polyphenols

2.6.2 DPPH自由基清除能力的測定 以吸光度Y為縱坐標,DPPH標準溶液質量濃度X(mg/mL)為橫坐標,得回歸方程為:Y=0.1107X-0.0104(R2=0.9996),說明吸光度與DPPH溶液濃度線性關系良好。由圖9可知,地榆多酚對DPPH自由基具有顯著的清除能力。在0.5～3.0 mg/mL的質量濃度范圍內,地榆多酚清除DPPH自由基的能力隨著濃度的增加而增加,質量濃度達到2.5 mg/mL以后,增加趨勢趨于平緩。地榆多酚清除DPPH自由基的能力與濃度呈線性相關:Y=18.44x+37.25(R2=0.991),半抑制質量濃度(IC50)為0.691 mg/mL。

2.6.3 還原能力的測定 由圖10可知,隨著質量濃度的增加,地榆多酚和VC的吸光度值都增加,表明還原能力隨著多酚質量濃度的增加而增加。在0.5～3.0 mg/mL范圍內,地榆多酚的還原能力大于VC。地榆多酚溶液的還原能力與濃度呈線性相關:Y=0.170x+0.422(R2=0.961)。

圖9 地榆多酚清除DPPH自由基的能力Fig.9 Scavenging DPPH free radical capacity of Sanguisorba officinalis polyphenols

圖10 地榆多酚的還原能力Fig.10 The reduction capability of Sanguisorba officinalis polyphenols

3 結論

通過比較吸附率和解吸率,XAD-8大孔樹脂是分離純化地榆多酚的最佳樹脂類型。地榆多酚分離純化的工藝條件為:上樣液濃度2.5 mg/mL,pH5.0,吸附平衡時間為3 h,洗脫液乙醇體積分數60%;上樣流速1.0 mL/min,洗脫流速1.5 mL/min。地榆多酚經XAD-8樹脂純化后多酚純度從20.79%提高到62.97%,提高3.0倍。XAD-8樹脂對地榆多酚具有吸附速度快,解吸效果好等優點。

抗氧化能力研究結果表明地榆多酚具有較強的抗氧化能力。地榆多酚具有還原能力和對羥基自由基、DPPH自由基清除能力。在0.5～3.0 mg/mL范圍內,地榆多酚的還原能力大于VC。當濃度大于0.25 mg/mL時,地榆多酚的清除羥自由基的能力超過VC;地榆多酚對羥自由基和DPPH自由基的半抑制質量濃度(IC50)分別為0.179 mg/mL和0.691 mg/mL。實驗結果可以為地榆多酚的進一步開發利用提供理論基礎。

[1]袁振海,孫立立.地榆現代研究進展[J].中國中醫藥信息雜志,2007,14(3):90-92.

[2]夏紅,孫立立,孫敬勇,等.地榆化學成分及藥理活性研究進展[J].食品與藥品,2009,11(7):67-69.

[3]毛迪銳,姜貴全,曹佳碩,等.響應面法優化地榆根多酚提取工藝[J].北華大學學報(自然科學版),2015,16(1):100-105.

[4]孫協軍,李秀霞,勵建榮,等. 樹脂法分離純化山楂黃酮[J].食品工業科技,2014,35(16):201-206.

[5]戴群晶.用茶末及廢茶枝葉提取高純茶多酚的研究[J].現代食品科技,2007,23(1):45-48.

[6]TANG Zhonghai,QIN Jingping,XU Xiaona,et al. Applying silica gel column chromatography purify resveratrol from extracts of morus alha L.Leaf[J].Journal of Medicinal Plants Research,2011,5(14):3020-3027.

[7]歐陽樂,王振宇,劉冉,等. HPLC法分離鑒定樟子松樹皮多酚研究[J].食品工業科技,2013,34(13):276-280.

[8]Kohler N,Wray V,Winterhalter P. Preparative isolation of procyanidins from grape seed extracts by high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography A,2008,1177:114-125.

[9]劉榮,何嬌,王振宇.大孔樹脂對樟子松樹皮多酚的純化工藝的研究[J].食品工業科技,2013,34(11):201-206.

[10]陶莎,黃英,康玉凡,等.大孔吸附樹脂分離純化紅小豆多酚工藝及效果[J].農業工程學報,2013,29(23):276-285.

[11]張智,于震,王振宇,等.落葉松樹皮多酚純化工藝研究[J].食品工業科技,2014,35(5):187-191.

[12]陳晨,胡文忠,田沛源,等.超聲輔助提取香蕉皮多酚工藝優化及其抗氧化性的分析[J].食品科學,2014,35(2):12-17.

[13]Brand-Williams W,Cuvelie M E,Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J]. Lebensm Wiss Technology,1995,28(1):25-30.

[14]古紹彬,吳影,董紅敏,等.蘋果多酚抗氧化作用及其清除自由基能力的研究[J].中國糧油學報,2013,28(4):58-62.

[15]陳海光,劉朝霞,于立梅.山竹果皮中多酚類物質的抗氧化性研究[J].食品工業科技,2011,32(9):107-110.

[16]張澤生,趙春艷,曹力心,等.大孔吸附樹脂分離純化山楂果中原花青素的研究[J].現代食品科技,2006,22(2):16-19.

Separation,purification and antioxidant activity of polyphenols fromSanguisorbaofficinalis

MAO Di-rui,JIANG Gui-quan*,ZHANG Shi-meng,SUN Ji-wei,CAO Jia-shuo

(Forestry College of Beihua University,Jilin 132012,China)

Through comparing the adsorption and desorption rates of 7 kinds of macroporous resin to polyphenols,the XAD-8 resin was selected to purify polyphenols ofSanguisorbaofficinalis. The optimal purification conditions were the sample concentration of 2.5 mg/mL,pH5.0,the adsorption equilibrium of 3 h,ethanol elution volume fraction of 60%,the sample flow rate of 1.0 mL/min,elution flow rate 1.5 mL/min. After purification ofSanguisorbaofficinalispolyphenols,the polyphenol purity were increased from 20.79% to 62.97%. Polyphenols had strong antioxidant capacity,the scavenging hydroxyl free radical activities and reducing activities of it were superior to VC,the IC50values of hydroxyl radical and DPPH radical were respectively 0.179 mg/mL and 0.691 mg/mL.

Sanguisorbaofficinalis;polyphenols;purification;antioxidant

2015-02-13

毛迪銳(1978-)，女，碩士，講師，研究方向：天然產物開發利用，E-mail:mdrteacher@163.com。

*通訊作者:姜貴全(1975-)，男，博士，教授，研究方向：天然產物化學，E-mail:jiangguiquan11@163.com。

吉林省植物化工創新團隊(20130521022JH)； 吉林省醫藥專項(20140311056YY)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.005