環境因子及接種量對單增李斯特菌生長/非生長界面的影響

周小紅,李學英,楊憲時,劉尊雷

(中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090)

環境因子及接種量對單增李斯特菌生長/非生長界面的影響

周小紅,李學英,楊憲時*,劉尊雷

(中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090)

單增李斯特菌在實驗設定的環境條件下,通過10倍梯度稀釋將菌懸液分別稀釋到101、103、105、107CFU/mL四個接種水平,然后接種到TSB-YE肉湯中，培養基置于恒溫培養箱中進行培養,然后通過肉眼觀察培養基濁度并結合涂布TSA-YE平板對其生長/非生長情況進行判定,通過Logistics多項式回歸模型對處理的數據建立了單增李斯特菌生長/非生長的界面模型。實驗結果表明不同生長溫度,pH和鹽度的交互作用對單增李斯特菌的生長/非生長界面的影響較大,接種量的大小也會影響單增李斯特菌生長/非生長過渡區域的具體位置,但具體原因和作用機制還有待進一步研究。該研究為抑制單增李斯特菌生長的環境因子條件范圍和實際產品中的污染嚴重程度提供一定的參考依據,對于有潛在單增李斯特菌污染的產品來說,這為加強產品的柵欄因子,優化工藝條件以提高其安全度也提供了重要的參考。

單增李斯特菌,生長/非生長界面,影響

微生物生長/非生長模型描述了柵欄因子的協同作用對微生物生長的影響,這些模型特別適合用來評估溫和加工食品中微生物暴露量的風險性[1]。大部分已建立的生長/非生長模型是基于環境因素如溫度、鹽度(水分活度)、pH和抑菌劑等,而這些研究是在含有較高接種量的實驗培養基進行的[2]。然而食品中發生致病或導致中毒等檢測到的微生物濃度往往較低。許多食源性致病菌在較低劑量就能使人感染或中毒,尤其是對于一些免疫力低下的人群[3]。

一些研究中有報道微生物的污染程度對于微生物的生長有顯著影響,因此在建立微生物生長模型中應該考慮微生物的接種水平。本文探討了不同溫度、鹽度和pH的交互作用對單增李斯特菌生長/非生長情況的影響,并且測定了所設定環境條件下不同接種水平對單增李斯特菌生長狀況的影響,旨在分析除了溫度、鹽度和pH交互作用對微生物生長的影響外,進一步探討不同微生物接種水平對微生物生長的影響,為微生物生長/非生長界面受環境因子及微生物接種水平的影響提供定量的參考數據,并為實際生產過程中食品中微生物生長/非生長界面模型的建立提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌種單核細胞增生李斯特菌(LM54001) 購自中國藥品生物制品研究所;含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE),含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE),腦心浸液(BHI) 均為北京陸橋技術有限公司提供。

Sensitire Automated Microbiology System微生物鑒定和藥敏分析儀 英國TECK Diagnostic Systems公司;ESCO CA2-4A1生物安全柜 上海生叉儀器有限公司;LabMASTER-aw型水分活度儀 瑞士Novasina公司;YXQ-LS-50SII全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司;Sanyo MIR 253、553高精度培養箱 日本三洋科研設備公司;Sanyo MIR 150、153恒溫培養箱 日本三洋科研設備公司;pHS-3C型數顯酸度計 上海偉業儀器廠;SA-960-II SHJ-系列凈化工作臺 上海凈化設備廠;721型可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

鄰苯二甲酸氫鉀、硼砂、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸等化學試劑(AR) 均由國藥集團化學試劑上海分公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的準備 菌株采取斜面低溫保藏法[4]于4℃冰箱中保藏。每月移種一次,實驗前用無菌接種環挑取一至兩環加入無菌TSB-YE液體培養基中,37℃[5]下培養至菌液濃度達到108CFU/mL[6],以作為菌懸液備用。

1.2.2 實驗設計 為了了解單增李斯特菌在各環境因子和不同接種水平下的生長/非生長界面,本實驗采用部分分析因子設計方案。因子和水平的選擇主要基于前期實驗的單因素實驗[7]以及一些相關參考文獻[8]。選擇接種量、溫度、鹽度和pH四個因素,其中接種量分別為101、103、105、107CFU/mL,溫度分別為0、4、10、15、20、25、30℃,鹽度分別為0.5%、2.5%、4.5%、6.5%、8.5%,pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,實驗結合TSB-YE培養基和涂布TSA-YE平板對單增李斯特菌的生長與非生長狀況進行了全因子實驗。

1.2.3 生長/非生長實驗 根據實驗設計,配制TSB-YE液體培養基,調節其鹽度、pH到各實驗所需的條件下,然后將各培養基分裝到各個試管中,121℃下滅菌20min。將菌懸液分別以10倍梯度稀釋到101、103、105、107CFU/mL四個接種水平,單增李斯特菌的初始接種量通過涂布TSA-YE平板計算得到。各試管震蕩混勻后放入相應溫度的恒溫培養箱,根據前期的實驗結果,分別培養不同的時間,每組實驗做兩個平行,培養結束后觀察各試管的混濁度。如果試管中菌液混濁度明顯,則判定其生長,并記為1,對于菌液混濁度不明顯或者有質疑的試管。則對該試管進行涂布確認,并將菌種培養48h后的菌落總數與初始接種菌數進行比較,如果最終的菌量比初始接種量多于0.5logCFU/mL[9],則判定單增李斯特菌生長,并記為1,否則記為0。對于實驗結果與預測結果有偏差的實驗數據,按上述方法再次進行重新測定確認,如果還是與預測結果不符,則作為異常點保留。

1.2.4 模型的建立 采用多項式logistic回歸模型來擬合實驗數據,分析方法通過R軟件的GLM函數實現。該模型是由Ratowsky[10]等人通過微生物生長動力學模型修正而來,此模型為概率模型,通過似然比卡法統計量來檢驗模型的擬合效果。該模型描述了微生物的生長概率與不同的培養溫度,培養基的pH,NaCl濃度之間的關系,具體模型如下:

Logit(p)=ln[p/(1-p)]=F

式(1)

式(1)中,p為微生物生長概率,p∈(0,1),F如下:

F=a0+a1T+a2pH+a3bw+a4TpH+a5Tbw+a6pHbw+a7T2+a8pH2+a9bw2

式(2)

式中ai為模型擬合參數(i=0,1,2,3……9);T為微生物培養溫度;pH為培養基的pH;bw=(1-aw)0.5,aw為培養基水分活度。

為了更好地闡述該回歸模型在描述單增李斯特菌的生長/非生長界面的生物學意義,令p=0.1、0.5、0.9并用Microsoft Excel Solver來計算這三種情況下生長/非生長界面上的預測T、pH和bw值。

2 結果與分析

2.1 生長/非生長實驗設計數據及結果

不同接種量單增李斯特菌在不同生長溫度、鹽度和pH條件下的生長/非生長實驗設計及接種量為101CFU/mL時的生長/非生長情況如表1,其中“1”表示生長,“0”表示不生長。從所選的數據可以看出單增李斯特菌在低溫下(15℃以下)出現生長情況較少,溫度越低則出現生長情況越少,鹽度越高則出現的生長情況也越少;如在15℃、pH5.5時,單增李斯特菌生長較非生長多,pH≥6.0時,在所有測定的鹽度下生長的情況等于1,而pH為4.5時,生長的情況均為0。因此可以看出pH(4.0～7.5范圍內)高的環境更利于該菌株的生長。從所選數據可以得出溫度,pH和鹽度對單增李斯特菌的交互影響較為明顯。當鹽度為4.5%,溫度為15℃,pH為5.0時,單增李斯特菌不生長,而保持鹽度,溫度不變,pH為6.0時,單增李斯特菌則生長;當保持溫度,pH不變,鹽度為2.5%時,則單增李斯特菌出現生長。

表1 實驗設計表及結果

注:“*”表示異常點。

2.2 模型擬合結果及分析

單增李斯特菌在不同接種水平下的生長/非生長界面的logistic回歸模型相關參數的預測值和標準偏差如表2所示。所有實驗數據經過Excel表處理后,通過R軟件的GLM函數對生長/非生長界面的logistic回歸模型擬合計算后,得到的各個參數預測值和標準差(p<0.05),從表中數據可看出,各預測值和標準差的相關性較好。

表2 不同接種量單增李斯特菌生長/非生長界面logistic回歸模型預測值和標準差

2.3 接種量對單增李斯特菌生長概率的影響

圖1為25℃條件下接種量分別為101、103、105、107CFU/mL的單增李斯特菌生長/非生長界面的橫截圖[11]。

圖1 不同接種量單增李斯特菌對應的生長/非生長界面截面圖Fig.1 Predicted growth/no growth interfaces with respect to pH and salinity at 25℃,for Listeria monocytogenes注:圖中“○”表示單增李斯特菌生長概率為0;“●”表示單增李斯特菌生長概率為1。虛線表示p為0.1的生長/生長界線,實現表示p為0.5的生長/生長界線,點線表示p為0.9的生長/生長界線。三條線之間的區域為p∈[0.1,0.9]轉換區域,圖2～圖4同。

由圖1的截面圖可以看出,pH和鹽度對單增李斯特菌生長/非生長的交互影響較顯著,而隨著接種水平的變化,生長與非生長界面的過渡區域開始發生移動,在接種濃度較低如由101CFU/mL增加到103CFU/mL時,生長與非生長界面的變化還不是很明顯,而當接種濃度達到105CFU/mL和107CFU/mL時,生長與非生長界面明顯向下移動。接種濃度越大,抑制微生物生長所需的條件越嚴苛。而且接種濃度不同,0.1、0.5、0.9三條生長/生長界線間的轉換區域寬度也不同,接種量為107CFU/mL時,生長非生長界面在p∈[0.1,0.9]轉換區域最平緩。所以接種量對微生物生長/非生長還是會產生一定的影響,這可能與初始接種菌數對微生物的生長起點會產生影響有關,也可能與菌種細胞間的相互作用有關,其具體作用機制和產生此結果的原因還有待進一步的研究,

2.4 環境因子對單增李斯特菌生長概率的影響

繪制不同溫度,鹽度和pH下p=0.1、0.5、0.9時的生長/非生長界線,見圖2～圖4。轉換區域之外的空間即為微生物生長和不生長兩種狀態,這對實際生產來說是最有意義。

2.4.1 溫度對單增李斯特菌生長概率的影響 15、20、25、30℃下鹽度和pH的交互作用對單增李斯特菌的生長概率影響的生長/非生長界面見圖2,從圖2中可以看出,隨著溫度的增加,轉化區域在下移,出現絕對增長的情況變多;隨著溫度的降低,三條曲線的距離逐漸縮短,轉換區域在縮小,即較低的溫度下,pH和水分活度發生較小的變化時,便會對單增李斯特菌的生長概率造成極大的影響。這個和其他文獻里面報道的情況相同[12-13]。單增李斯特菌是一種對環境耐受力極強的嗜冷菌,但是由于在低溫下其生長情況較不太穩定,建模數據不及溫度高一些的理想,這樣會影響建模的結果,因此文章選取了10℃以上的溫度。從圖中可以看出,15℃下單增李斯特菌在鹽度較低,pH接近中性或偏堿性的情況下生長較旺盛。當鹽度為6.5%,pH5.5時,只有在15℃以下,單增李斯特菌的生長才會受到抑制,而當溫度越高時,鹽度處在單增李斯特菌生長較理想的鹽度時,單增李斯特菌的生長已經不受pH的抑制。例如,當T=30℃,鹽度為4.5%,pH5.0時,單增李斯特菌在p=0.5的生長概率為1,即判定為生長。很明顯地可以看出,溫度對p∈[0.1,0.9]轉換區域影響較大。

圖2 不同溫度時單增李斯特菌生長/非生長界線圖Fig.2 Growth/no growth boundaries at different tempreature for the predicted growth probability of Listeria monocytogenes

2.4.2 鹽度對單增李斯特菌生長概率的影響 NaCl濃度為2.5%、4.5%、6.5%和8.5%時,單增李斯特菌的生長/非生長界面見圖3。從圖3中可以看出,鹽度越高,其轉換區域往溫度和pH高的地方移動。圖中很明顯地看出,鹽度對單增李斯特菌生長概率的影響較大。pH很低時,鹽度對單增李斯特菌的抑制作用增強。當鹽度較高時,可以在較高的溫度下,抑制單增李斯特菌的生長。例如當鹽度為8.5%時,溫度在15℃以下時,單增李斯特菌在pH<6.0條件下均受到抑制,而當鹽度為2.5%時,pH<5.0時其生長才受到抑制,說明溫度較低時,鹽度對單增李斯特菌生長的影響較大。當鹽濃度較低時,溫度和pH的交互作用對單增李斯特菌生長抑制的影響較大。本實驗是通過調節培養基鹽度來測得其對單增李斯特菌生長的影響,而NaCl達到一定濃度會形成高滲透壓,會對細菌有著一定的抑制作用,所以鹽度對單增李斯特菌的生長會產生較大的影響。

2.4.3 pH對單增李斯特菌的生長概率的影響 pH在4.0、5.0、6.0和7.0時單增李斯特菌的生長/非生長界面見圖4。當pH越高時,單增李斯特菌的生長狀況越好。當pH=7.0時,在實驗設定的溫度和鹽度范圍內,單增李斯特菌的生長完全不受抑制,而當pH=4.0時,不論溫度和鹽度如何變化,單增李斯特菌都不生長,即生長受到完全抑制。在pH=5.0和pH=6.0時,單增李斯特菌的生長/非生長轉換區域往鹽度高和溫度低的方向移動。當pH越高時,或者處于微酸性或中性時,抑制單增李斯特菌生長時的鹽度和溫度條件越苛刻。而pH達到4.0時,其他兩個因子的交互作用對單增李斯特菌生長的影響不大。有學者報道單增李斯特菌的生長pH為4.3～9.6[14],最適pH為中性至弱堿性[15]。這說明當微生物所處環境因子之一接近極限值時,其余因子對微生物生長的影響會很小[16-17]。實驗數據顯示,pH在7和7.5時,單增李斯特菌的生長情況較類似,這也說明單增李斯特菌較適宜在中性或弱堿性環境中生長。這個對于實際產品的生產尤為重要,為了抑制單增李斯特菌生長時,可以通過添加一些食用有機酸適當地降低產品的pH。從圖4可以看出,當pH為6.0,鹽度低于8.5%時,單增李斯特菌可以在各溫度下生長,溫度起不到抑制其生長的作用。

圖4 不同pH時單增李斯特菌的生長/非生長界線圖Fig.4 Growth/no growth boundaries at different pH for the predicted growth probability of Listeria monocytogenes

3 結論與討論

微生物安全問題是食品界最為突出的問題,如何抑制食品中有害微生物的生長并極大延長產品的貨架期是食品制造商最為關心的話題。隨著食品預測微生物的發展,有關微生物的各種預測模型被建立,這些模型不僅摒棄了傳統預測方法的耗時,耗力和耗財的缺點,同時也大大增加了預測結果的準確性。根據預測模型,可以得到在不同的環境條件例如溫度、pH、鹽度(水分活度)下的微生物生長情況,從而制定出更為嚴格、更為安全的生產工藝。研究人員更多地是建立微生物生長動力學模型用來計算產品的貨架期,然而這類模型只能給出微生物生長的信息,卻不能給出微生物不生長的信息。與腐敗菌達到一定數量食品才會出現問題不同,致病菌處于任何生長期都有引起中毒的潛在危險,對于含有潛在致病菌和產毒素菌株的食品來說,描述其生長/非生長情況比描述其生長速率更有意義[18]。

從圖2～圖4中可以很明顯地看出不同生長溫度,pH和鹽度的交互作用對單增李斯特菌的生長/非生長界面的影響較大。同時實驗表明通過適當降低生長溫度和pH以及提高培養基的鹽度可以有效地抑制單增李斯特菌的生長。生長/非生長界面圖可以很直觀地描述不同環境因子之間的交互作用對單增李斯特菌生長概率的影響。同時,如圖1所示,接種量對單增李斯特菌的生長/非生長過度界面也有一定的影響,這可能與初始接種菌數對微生物的生長起點會產生影響有關,也可能與菌種細胞間的相互作用有關。但是具體作用機制和產生此結果的原因還有待進一步的研究,因此本研究結果只能提供有限參考。生長/非生長模型能描述出微生物不生長情況,通過得到抑制微生物生長的環境因子組合可以有效地防止微生物對產品的污染,可以作為新產品研發或者風險評估時的依據,通過得到特定環境條件下產品中主要致病菌或腐敗菌的生長概率,更好地優化生產工藝以抑制這類微生物的生長,提高產品的安全性。但是文中只選取了三個環境因子,而實際產品中由于多種防腐劑的添加,或者輻照等工藝的加入,環境條件要更為復雜。本文中建立的logistic回歸模型可以為抑制單增李斯特菌生長的環境因子條件范圍和實際產品中的污染嚴重程度提供一定的參考依據,對于有潛在單增李斯特菌污染的產品來說,這為加強產品的柵欄因子,優化工藝條件以提高其安全度也提供了重要的參考。但是由于實驗中采用的基質是TSB-YE液體培養基,相對于實際產品來說,條件較為苛刻,而實際產品更利于微生物的生長,同時由于各企業的標準不一樣,因此劃定生長/非生長的界線標準也與本文中不一樣,這樣也會導致生長/非生長界面模型的差異。因此需要進一步以實際產品為基質,研究單增李斯特菌的生長情況并建立特定產品的生長/非生長界面模型。

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Impact of environmental factors on growth/no growth interface model ofListeriamonocytogenesunder different inoculum size

ZHOU Xiao-hong,LI Xue-ying,YANG Xian-shi*,LIU Zun-lei

(East China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Shanghai 200090,China)

The growth/no growth responses ofListeriamonocytogeneswere monitored at different environmental factors,and inoculated concentration at four levels(101,103,105,107CFU/mL)by means of 10-fold dilution into tryptic soy broth added with 0.6% yeast extract(TSB-YE),and then cultivated in constant temperature incubator. The study was carried on tryptic soy agar added with 0.6% yeast extract(TSA-YE)plates and growth was monitored visually by observing the turbidity of the medium combined with plate counts. The growth/no growth interface ofListeriamonocytogeneswas modeled by using logistic polynomial regression. Results showed that the hurdle effects of temperature,salinity and pH had a significant influence on the growth/no growth ofListeriamonocytogenes,and inoculation size also had certain impact on the specific position of transition areas on growth/no growth interface ofListeriamonocytogenes,but its mechanism and more details need to be further discussed. This study provided certain references for controlling environmental factors to inhibit the growth of theListeriamonocytogenesand predicting the pollution extent in practical products. For products which have a potential risk ofListeriamonocytogenescontamination,this study also provided an important reference in strengthening the hurdle factors,optimizing process conditions and improving safety for real products.

Listeriamonocytogenes;growth/no growth interface;impact

2014-05-04

周小紅(1988-)，女，碩士，研究方向：食品科學與工程。

*通訊作者:楊憲時(1954-)，男，本科，研究員，研究方向：水產品加工與貯藏。

農業部引進國際先進農業科學技術項目 (2011-Z12)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0053-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.002