基于PB-CCD設計的固腸止瀉丸HPLC-DAD指紋圖譜研究△

劉妍如，呂楊，宋忠興，張歲玲，唐志書，劉力*，王興海

(1.陜西中醫學院 陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083；2.陜西中醫學院制藥廠，陜西 咸陽 712083)

·中藥工業·

基于PB-CCD設計的固腸止瀉丸HPLC-DAD指紋圖譜研究△

劉妍如1，呂楊1，宋忠興1，張歲玲1，唐志書1，劉力1*，王興海2

(1.陜西中醫學院 陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083；2.陜西中醫學院制藥廠，陜西 咸陽 712083)

目的：以Plackett Burman-Central Composite Design(PB-CCD)設計為基礎，通過分析固腸止瀉丸的高效液相指紋圖譜，完善其質量控制和評價方法。方法：基于試驗優化設計(DOE，Design of Experiment)原則，采用PB-CCD方法優化液相分析中的多種因素。樣品采用Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，0.2%甲酸/水-乙腈溶液線性梯度洗脫，以280 nm作為檢測波長，計算10批固腸止瀉丸及中間體指紋圖譜的相似度，評價各批樣品質量。結果：建立了固腸止瀉丸的高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)指紋圖譜，確認了21個共有峰，其中8個為主要成分色譜峰(標定峰)。結論：基于PB-CCD設計建立的固腸止瀉丸HPLC-DAD指紋圖譜分析方法，標定峰分離度較好，可用于該復方制劑加工過程中的質量控制。

固腸止瀉丸；試驗設計；高效液相色譜法；指紋圖譜

固腸止瀉丸源自醫圣張仲景經典名方“烏梅丸”，成方由烏梅、干姜、黃連、罌粟殼、木香、延胡索組成。具有調和肝脾，澀腸止痛，解痙，止瀉的功能[1-2]。目前研究建立的固腸止瀉丸HPLC定量分析方法大多只反映方劑中黃連的鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素等生物堿類成分，其他單味藥材中的成分很少體現[3-6]，也還沒有基于試驗優化設計(DOE，Design of Experiment)方法來研究固腸止瀉丸指紋圖譜的報道[7-8]。

本研究基于Plackett Burman-Central Composite Design(PB-CCD)設計，首先對影響指紋圖譜質量的液相色譜關鍵因素進行優化，然后利用優化后的液相條件，建立反映固腸止瀉丸中主要成分信息的高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)指紋圖譜，為固腸止瀉丸的質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相儀(包括配脫氣機、G1311C四元梯度泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315D DAD檢測器)；佑科FA2704b型分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；KQ-300DE型數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

乙腈為色譜純(Honeywell公司，批號分別為DK268，DK364)；甲酸為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20140421)；其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純化水。

固腸止瀉丸(陜西中醫學院制藥廠，批號分別為141201，141202，141204，141205，141206)；中間體(陜西中醫學院制藥廠，批號分別為141201，141203，141204，141205，141206)；對照品咖啡酸、鹽酸罌粟堿、延胡索乙素、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、6-姜辣素、異歐前胡素(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110885-200102，171214-201205，110726-201414，110733-201108，110732-201309，110713-201212，111833-201303，110827-201109)

2 方法

2.1 固腸止瀉丸供試品溶液配制

根據《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第二十冊(WS3-B-3870-98)對固腸止瀉丸樣品的處理方法，取固腸止瀉丸，研細，取粉末約0.5 g，精密稱定，置25 mL具塞三角瓶中，加甲醇溶液20 mL，超聲處理30 min，將提取液轉移至蒸發皿中，待溶劑蒸干后，再用0.1%甲酸水-乙腈(90∶10)溶液邊洗滌邊轉移至50 mL容量瓶中，直至將蒸發皿內殘渣完全洗凈，最后用0.1%甲酸水-乙腈(90∶10)溶液定容至刻度，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件

Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相：水(A)-乙腈溶液(B)。

2.3 影響因子設計

采用比例特定的乙腈-水混合洗脫系統，以不同比例甲酸調節流動相系統pH值。選用不同色譜柱類型、檢測波長、柱溫、線性梯度時間、流速、乙腈初始比例作為考察變量，以兩峰分離度之和∑Rs、歸一化分離因子r*(×10-10)、色譜信息量Ф和色譜分層響應效能HCRF作為響應因子，見表1[9]。

表1 影響因子及響應因子設計表(7因素2水平)

2.4 數據分析

以各因素無相互作用且對設計結果干擾少作為設計前提，采用Design-Expert Version 8.0.7統計軟件，首先對檢測波長、柱溫、梯度時間、進樣體積、流速、酸濃度、乙腈初始比例進行PB因子篩選；然后以CCD響應曲面法對重要因素進行尋優，以確定最優的參數設置，見表2。

2.5 方法學驗證

按照《中華人民共和國藥典》2010版一部對中藥質量控制方法的規定，對優化結果進行精密度、重復性、穩定性等方法學驗證。以咖啡酸、罌粟堿、延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、6-姜辣素和異歐前胡素為對照,鑒定指紋譜中主要成分。

表2 PB設計試驗方案(n=3)

3 結果與討論

3.1 液相色譜優化因子選擇

由于甲醇和分析物間氫鍵的相互作用，可能引入額外的共振結構并可能引起拖尾峰，因此選擇乙腈作為有機相。另外，色譜柱溫度也是影響極性化合物保留時間的重要參數，一般溫度升高，擴散系數也升高，這樣會導致更窄的峰和更高的分離效率。為了增加色譜柱使用壽命，將柱溫優化范圍設置為25～40 ℃。

3.2 PB試驗設計

為了在最少的試驗次數下獲得最佳的參數設置，選擇因子設計中的PB法作為篩選設計方法，以CCD響應曲面法對優化后的因素進行進一步優化，以∑Rs、r*(×10-10)、Ф、HCRF評價樣品的分離效能，見公式1～3。結果見表3。

公式1

公式2

HCRF=1000000n+10000Rmin+(tm-t1)

公式3

其中，R表示兩峰間分離度；n為理論塔板數；Rmin為最小分離度；tm-t1為最大與最小保留時間差；A為色譜峰面積。

∑Rs、r*(×10-10)是用于評價色譜分離質量的參數；Ф值指色譜信息量值，是用于評價色譜交互信息的參數；HCRF指分層色譜響應值，用于評價方法中分離峰個數、分離度和分析時間性能。

表3 PB響應因子結果

PB試驗的ANOVA結果顯示，Ф和HCRF項的p值分別為0.004 3和0.005 4，均小于0.01，說明各變量與HCRF回歸方程的關系非常顯著。擬合系數(R-Squared)分別為0.992 4和0.991 1，說明模型擬合度很好。

根據各影響因子對各響應因子的最大值運算結果，將影響不顯著的影響因子進行最大值預測并作為固定條件：檢測波長為280 nm；柱溫為40 ℃；流速為1.0 mL·min-1；甲酸濃度為0.2%；色譜柱類型為250 mm×4.6 mm，5 μm。

3.3 CCD試驗設計

在PB設計結果的基礎上，對進樣體積、線性梯度和乙腈初始比例因素進行尋優。試驗采用通用旋轉組合設計(Rotatable=6)，以Ф和HCRF作為響應因子進行三水平CCD試驗，結果見表4。

從Ф和HCRF項的ANOVA分析結果中可以看出，對Ф影響顯著的因素為進樣體積(p=0.000 3)和線性梯度時間(p=0.003 3)，乙腈初始比例對Ф影響不具有統計學意義(p=0.305 9>0.05)；對HCRF影響顯著的因素為線性梯度時間(p=0.003 4)和進樣體積(p=0.044 0)，乙腈初始比例對HCRF影響不具有統計學意義(p=0.106 6>0.05)。從Ф和HCRF的主效應圖可以看出，三因素交互作用顯著，進樣體積(A)越大，圖譜Ф和HCRF越高；而線性梯度時間(B)越長，對譜圖分析越不利。見圖1。

表4 Central Composite響應因子結果

根據方差分析響應曲面圖所示，進樣體積和線性梯度時間的交互影響是比較顯著的。在進樣體積不變的情況下，線性梯度時間越長，Ф和HCRF越??；而在線性梯度時間不變的情況下，隨著進樣體積的增加，Ф和HCRF增大。從HCRF響應曲面分析圖可以看出，進樣體積不變時，HCRF響應曲面曲率比Ф響應曲面曲率更大，說明線性梯度時間對HCRF(峰個數、分離度和性能)的影響更大。見圖1。最后得到響應方程：

Ф=254.867+5.099×進樣體積-0.945×線性梯度時間

HCRF=26 714 700+274 606×進樣體積-107 952×線性梯度時間

注：A.Ф分離效果影響因素主效應圖；B.Ф響應曲面分析圖；C.HCRF分離效果影響因素主效應圖；D.HCRF響應曲面分析圖圖1 分離效果影響因素主效應及響應曲面分析圖

根據上述篩選結果，在設計水平范圍內對響應因子做最大值計算。以3次重復試驗驗證因子分析結果，最終得到的色譜分析條件：色譜柱為Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為280 nm；柱溫為40 ℃；梯度時間為60 min；進樣體積為20 μL；流速為1.0 mL·min-1；乙腈初始比例為3.5%；甲酸濃度為0.2%。

3.4 方法學驗證

3.4.1 精密度試驗 取同一批供試品溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖。對21個共有峰以均值法進行差異性評價，結果表明各共有峰保留時間RSD 為0.02%～0.24%，主要成分共有峰面積RSD 為0.72%～1.01%，符合指紋圖譜的要求。

3.4.2 穩定性試驗 取同一批供試品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h進樣，記錄色譜圖。共有峰以均值法進行評價，結果表明各共有峰保留時間RSD為0.02%～0.34%，主要成分共有峰面積RSD為 0.36%～1.52%，證明供試液在24 h內穩定。

3.4.3 重復性試驗 取同一供試品5份，分別制備供試品溶液，進樣，記錄色譜圖。結果表明，共有峰保留時間RSD為0.02%～0.33%，峰面積RSD為0.38%～2.91%，表明該方法重復性較好。

3.5 固腸止瀉丸特征峰鑒定及不同批次制劑相似度評價

取10批固腸止瀉丸及中間體，按2.1項下方法分別制備供試品溶液，進樣，記錄色譜圖。通過與對照品混標圖譜比較，確定8個特征峰，分別為咖啡酸、罌粟堿、延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、6-姜辣素和異歐前胡素，見圖2。

將10批固腸止瀉丸及中間體的色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2004年A版，進行相似度評價。結果表明，除1個批次外，其他批次制劑及中間體的指紋圖譜相似度均>0.98。10批制劑及中間體的HPLC指紋圖譜相似度結果見表5。

注：1.4.934 min；2.7.505 min；3.8.498 min；4.8.969 min；5.10.762 min；6.12.425 min；7.12.688 min；8.12.943 min；9.13.509 min；10.15.136 min，咖啡酸；11.16.150 min；12.19.559 min；13.21.751 min，鹽酸罌粟堿；14.22.422 min，延胡索乙素；15.22.826 min；16.23.33 min，鹽酸藥根堿；17.28.858 min，鹽酸巴馬??；18.29.768 min，鹽酸小檗堿；19.33.207 min；20.61.028 min，6-姜辣素；21.64.607 min，異歐前胡素。圖2 固腸止瀉丸及中間體對照指紋圖譜

批次(2014-)1201120212041205120611011103110411051106對照指紋圖譜1201110.9990.9990.9990.3070.9810.9810.9810.9860.9851202110.9990.9990.9990.3080.9830.9840.9840.9880.98612040.9990.99910.9990.9990.3080.9770.9770.9770.9850.98312050.9990.9990.999110.3080.9810.9820.9820.9880.98612060.9990.9990.999110.3080.9810.9820.9810.9880.98611010.3070.3080.3080.3080.30810.3040.3040.3040.3070.43511030.9810.9830.9770.9810.9810.3041110.9970.98611040.9810.9840.9770.9820.9820.3041110.9970.98611050.9810.9840.9770.9820.9810.3041110.9970.98611060.9860.9880.9850.9880.9880.3070.9970.9970.99710.988對照指紋圖譜0.9850.9860.9830.9860.9860.4350.9860.9860.9860.9881

4 結論

近幾十年來，現代中藥復方制劑被廣泛用于疾病的預防與治療，但藥材中的活性成分非常復雜，使其應用受到限制[10-13]。目前已有應用高效液相色譜、質譜、核磁共振等分析技術對中藥活性成分進行的大量研究，但是這些研究還不足以全面反映中藥多成分的特點[14-15]。由于中藥的治療作用是基于多種成分互相作用而產生的，因此，其指紋色譜被認為是中藥質量控制最有利的方法，而這種技術也成功地應用于中藥制劑的質量控制中。相比于超高效液相色譜，高效液相色譜雖然分離效率較低，但對于成分復雜的中藥體系而言，分離可操作性更加理想，更適于大范圍的中藥指紋圖譜的檢測。

本研究設計了“三步”開發固腸止瀉丸HPLC指紋圖譜的方法，通過優化液相分析中的影響因素，確定可控參數，得到有效的線性梯度洗脫法，最后進行方法驗證以及指紋圖譜共有峰的比對。本研究為固腸止瀉丸的鑒定及質量控制提供新的手段，為中藥色譜指紋圖譜的分析提供新的思路。

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ApplicationofPlackett-Burman-CentralCompositeDesignforFingerprintAnalysisofGu-Chang-Zhi-XiepillbyHPLC-DADapproach

LIUYanru1，LYUYang1，SONGZhongxing1，ZHANGSuiling1，TANGZhishu1，LIULi1*，WANGXinghai2

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Xianyang712083，Shaanxi，China；2.ShaanxiChineseTraditionalMedicineAcademyPharmaceuticalFactory，Xianyang712083，Shaanxi，China；)

Objective：To identify and evaluate quality of Gu-Chang-Zhi-Xie pill (GCZX)，APlackett-Burman-Central Composite Design with response surface analysis method was implemented to optimize and validate the chromatographic system of GCZX fingerprint.Methods：Firstly，the controllable factors were selected，design of experiments (DOEs) were performed for further optimization.Then，injection precision，repeatability，and sample stability test were performed.Results：A feasible and reliable HPLC-DAD system was established by using a acetonitrile-0.2% formic acid linear gradient elution with a column temperature of 30 ℃ and a detection wavelength of 280 nm.21 common peaks were found and 8 characteristic peaks were identified referred to reference substances.Conclusion：The strategy of optimization method can be applied for the development of fingerprints in the quality control of Gu-Chang-Zhi-Xie pill.

Gu-Chang-Zhi-Xie pill；design of experiment；HPLC-DAD；fingerprint

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.017

2015-02-10)

陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2011KTCG03-02)

*

劉力，碩士生導師，研究方向：潰瘍性結腸炎的發病機制與中醫藥治療研究、脾胃病診療技術的標準化與臨床療效評價方法研究；Tel：(029)38185009，Email：liuyan791@163.com