牛、羊布魯氏菌病試管凝集試驗與微量凝集試驗檢測方法的比較

趙鳳菊，李璐，閆明媚，于學武，陳瑤，李井春

（遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽110164）

牛、羊布魯氏菌病試管凝集試驗與微量凝集試驗檢測方法的比較

趙鳳菊，李璐，閆明媚，于學武，陳瑤，李井春

（遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽110164）

血清學檢測方法因其快速、安全、高效等特點被廣泛應用于布魯氏菌病的檢測和診斷。本文通過對保存的226份牛、羊血清樣品同時使用試管凝集法與微量凝集試驗進行檢測并比較分析其在診斷中的意義。結果顯示，微量法與試管法兩者的符合率為97.79%，兩種檢測方法無統計學差異。但微量法的陽性檢出率要高于試管法，同時由于微量法具有操作簡便、快捷及結果判定更為直觀、簡單等優點，因此，微量凝集試驗更適宜在我國基層布魯氏菌病大量樣本監測、診斷中推廣應用。

布魯氏菌??；試管凝集試驗；微量凝集試驗

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡稱布病，是由布魯氏菌屬（Brucella）細菌引起的動物源性人獸共患傳染病[1-2]，可引起天然宿主網狀內皮系統持續性感染[3]。本病多發于家畜中的牛、羊、豬，引起高熱、流產等癥狀，陽性病畜暴露人群有高度的感染風險[4]。該病在全世界分布十分廣泛。近年來，隨著集約化養殖程度的不斷提高，我國2013年全國報告的布病發病率比1993年增加了170倍，2012年畜間布病疫情發生5 404次，涉及19個省[5]。由此可見，布病的防控形勢依然嚴峻，布病不僅嚴重危害人類健康，還對畜牧業發展和對外貿易造成巨大影響。布病的早期準確診斷是有效治療和預防的關鍵環節。目前用于檢測的技術有很多，公認比較成熟有效的實驗室診斷方法有細菌學診斷技術、PCR技術、凝集試驗、補體結合試驗、ELISA、熒光偏振試驗、乳環試驗等。長期以來，在我國動物布病監測中主要采用國標中規定的虎紅平板凝集試驗（RBPT）、全乳環狀試驗（MRT）、試管凝集試驗（SAT）和補體結合試驗（CFT）。其中SAT是我國在動物布病監測、檢疫中應用最廣的復檢方法之一。我國最早于1988年有微量凝集試驗檢測布病抗體的相關研究的報道[6]。

本文對保存的牛、羊血清同時采用SAT和微量凝集試驗進行血清學檢測，對比兩種檢測方法的差異，以鑒定、證實、評價微量凝集試驗在布病監測中的實用價值，從而為微量凝集試驗能否在動物布病監測工作中應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑布病試管凝集抗原、標準陰性血清及標準陽性血清購自中國獸醫藥品監察所。0.5%石炭酸生理鹽水、0.5%石炭酸的10%鹽溶液等其他試劑均由遼寧省動物疫病預防控制中心配制。

1.2 血清樣本臨床樣品為遼寧地區采集的牛、羊血清樣品共226份，其中經RBPT、SAT和CFT方法檢測均為布病抗體陰性且臨床健康牛、羊的血清樣品分別為68份、30份；布病抗體檢測陽性的牛、羊血清樣品分別為80份、48份。

1.3 試驗器材96孔U型微量凝集板、三分玻璃試管、十二通道10～100 μL可調微量移液器、單通道2～10 μL可調微量移液器、一次性凝集反應封膜、試管架、振蕩器、37℃恒溫培養箱。

1.4 試驗方法及判定標準

1.4.1 試管凝集試驗試驗方法及判定標準參照我國《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2002）。

1.4.2 微量凝集試驗試驗方法及判定標準。

1.4.2.1 試驗方法每份受檢血清用4個U型孔。羊血清的稀釋時，在第1孔加入184 μL 0.5%石炭酸的10%鹽溶液，第2～4孔分別加入100 μL。然后取被檢血清16 μL，加入第一孔混勻。再從第1孔吸取100 μL混合液加入第2孔，如此倍比稀釋至第4孔，從第4孔棄去混合液100 μL。稀釋結束后，從第1至第4孔的血清稀釋度分別為1:12.5、1:25、1:50和1:100。牛血清稀釋法與上述基本一致，差異是第1孔加192 μL 0.5%石炭酸生理鹽水和8 μL被檢血清。將100 μL的工作抗原加入已稀釋好的各孔中，并振蕩混勻，羊的血清稀釋則依次變為1:25、1:50、1:100和1:200，牛的血清稀釋度則依次變為1:50、1:100、1:200和1:400。用一次性凝集反應封膜封板后，于37℃溫箱孵育24 h。每次試驗均應設陽性血清、陰性血清和抗原對照。陰性對照血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清相同。陽性對照血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與受檢血清相同?？乖瓕φ眨合♂尩墓ぷ骺乖?00 μL，再加100 μL稀釋液，觀察抗原是否有自凝現象。

1.4.2.2 判定標準凝集反應程度分為5個等級，分別記為“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”，按以下說明判定：++++：菌體完全凝集，1～4孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底；+++：菌體幾乎完全凝集，1～3孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，第4孔孔底呈現白色點狀；++：菌體凝集顯著，1～2孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，3～4孔孔底呈現白色點狀；+：凝集物有沉淀，第1孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，2～4孔孔底呈現白色點狀；-：無凝集，1～4孔孔底均呈現白色點狀。

1.4.2.3 結果判定當陽性血清出現完全凝集（++++），而陰性血清無凝集（-），抗原對照無自凝（-）現象時，試驗成立，按以下對試驗結果判定：受檢血清出現“++”及以上凝集現象時，判定為陽性（+）。受檢血清出現“+”凝集現象時，判定為可疑（±）。受檢血清出現“-”時，判定為陰性（-）。

1.4.3 統計分析方法試驗結果使用Excel進行錄入，對SAT和微量凝集試驗結果應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

用上述方法對148份牛血清、78份羊血清樣品同時進行SAT和微量凝集試驗，利用SPSS 17.0軟件對SAT和微量凝集試驗結果進行統計學分析，P＞0.05，Kappa值為0.877，檢測結果見表1。通過試驗表明兩種方法對檢測結果完全符合的為221份，占97.79%；SAT檢測陰性、微量凝集試驗檢測陽性的為5份，占2.21%，微量凝集試驗的陽性檢出率要高于SAT；微量凝集試驗高于SAT一個滴度的為16份，占7.08%。

表1 SAT和微量凝集試驗檢測結果Table1 Indicators of SAT and microscale agglutination test

3 討論

布魯氏菌病不僅損害人類健康，影響著包括乳、肉及其制品、皮、毛等在內的民生需求，甚至還影響畜牧業發展乃至國際貿易和旅游業。尤其是由其引起的人類波狀熱、慢性感染以及反芻動物流產和睪丸炎，至今尚無法根治。因此，定期對動物間布病的監測仍是有效預防、控制本病的關鍵。

雖然目前已有較多先進的檢測方法可以用于本病的檢測診斷，但由于因條件所限，SAT在我國基層仍為本病主要檢驗方法。而SAT方法由于血清用量大、所用耗材多、操作繁瑣、結果判定受主觀因素影響較大，因此不適于大量樣本的監測。本文利用SPSS 17.0軟件對SAT和微量凝集試驗結果進行統計學分析，表明這兩種試驗方法在統計學上無顯著差異。Kappa值作為評價試驗可靠性指標之一，Kappa值越接近1.0，表明試驗的可靠性越高。若Kappa值＞0.6，則表示一致性相當可靠。本文通過利用SPSS 17.0軟件對試驗結果進行Kappa值分析，表明這兩種檢測方法具有很高的一致性。同時，微量凝集試驗的陽性檢出率要高于SAT，而布病抗體檢測陰性且臨床健康牛、羊的血清樣品中未出現微量凝集試驗陽性。由此可見，微量凝集試驗檢測方法的應用可以有效的避免出現漏檢、誤檢現象的出現，可以在最短的時間內將布魯氏菌病陽性動物篩選出來，防止疫情擴散、蔓延，有效減少動物布魯氏菌病感染人類的機會。

微量凝集試驗不僅操作更為方便、快捷，有效節約了血清樣品與試劑的用量，而且也克服了SAT在結果判定過程中主觀因素的影響，使得結果判定更為客觀、簡便、直觀，更適宜在基層推廣、應用。因此，微量凝集試驗對大規模動物檢測應用、進出口動物及其產品檢驗檢疫把關、食品安全監控以及畜牧業疫病防控均有重要意義。

[1]孫志華，劉良波，張預，等.布魯氏菌外膜蛋白VirB4在感染胚胎滋養層細胞中的作用分析[J].中國人獸共患病學報，2014，30（10）：990-996.

[2]龐峰，賈曉曉，趙天靖，等.羊種布魯氏菌Wzt基因的克隆及原核表達[J].中國畜牧獸醫，2014，41（11）：54-57.

[3]Al Dahouk S,Fleche PL,Nockler K,et al, Evaluation ofBrucellaMLVA typing for human brucellosis[J].JMicrobiolMethods,2007, 69:137-145.

[4]訾占超，亢文華，馬英，等.熒光偏振技術在布魯氏菌病檢測中的應用[J].中國人獸共患病學報，2014，30（10）：1057-1061，1065.

[5]崔步云.中國布魯氏菌病疫情形勢與研究進展[A].第四屆全國人畜共患病學術研討會[C].2014年中國狂犬病年會中國畜牧獸醫學會獸醫公共衛生學分會第四次學術研討會論文集，2014，53.

[6]張雙宅.布魯氏菌微量凝集試驗的建立[J].醫學動物防制，2012，28（4）：399-400.

（編輯：張婷婷）

Comparison of serum tube agglutination test and micro agglutination test on brucellosis detection in cattle,goat and sheep

Zhao Fengju,Li Lu,Yan Mingmei,Yu Xuewu,Chen Yao,Li Jingchun

（Animal Epidemic Diseases Control and Prevention Center of Liaoning Province,Shenyang110164）

Serologic tests were widely used in the detection and diagnosis of brucellosis,because of its fast,safe,efficient,and other characteristics.In order to compare and analyze its significance in diagnosis,a total of 226 cattle,goat,and sheep serum samples were detected by both tube agglutination and micro agglutination test at the same time in this study.The results showed that the coincidence rate of the tube agglutination test and micro agglutination test was 97.79%;and there was no significant difference in two methods.However,the positive rate of micro agglutination test was higher than tube agglutination test.Micro agglutination test was more suitable for brucellosis surveillance and diagnosis,for it was a simple,fast and more intuitive diagnosis method.

Brucellosis;Tube agglutination test;Micro agglutination test

S858.23文獻標識碼：B文章編號：1672-9692(2015)02-0008-03

2015-01-04

趙鳳菊（1978-），女，碩士，高級獸醫師，主要從事動物疫病防控工作。

遼寧省農業攻關支撐計劃，編號：201404210