抗野豬和地方豬仔豬營養性腹瀉的研究

田玉民，蘇玉虹，王玉彬，高群，張會君，王鐵良

（遼寧醫學院，遼寧錦州121001）

抗野豬和地方豬仔豬營養性腹瀉的研究

田玉民，蘇玉虹，王玉彬，高群，張會君，王鐵良

（遼寧醫學院，遼寧錦州121001）

野豬和地方豬養殖過程中仔豬營養性腹瀉率高，嚴重地影響了養殖的經濟效益。本研究通過PCR擴增和DNA測序，檢測到豬乳糖酶基因（LCT）5′非編碼區增強子和啟動子多態性位點；通過雙熒光報告系統實驗，確定了LCT多態性位點調控基因的表達；經統計分析，LCT多態性與仔豬乳糖消化性狀相關顯著。通過飼養試驗，篩選了抗腹瀉飼料添加劑。上述研究形成了抗野豬和地方豬仔豬營養性腹瀉的綜合配套技術，為后續推廣應用奠定了基礎。

野豬仔豬；地方豬仔豬；營養性腹瀉；乳糖酶基因；飼料添加劑

豬肉是我國肉類消費的主體，占肉類總消費的60%以上[1]。據統計，2012年我國豬肉產量5 342.7萬噸，人均豬肉消費量38.7 kg，豬肉消費基本趨于飽和，消費理念由追求數量轉向追求質量[2]。與國內占優勢的國外豬種相比，我國地方豬肉質在色澤、嫩度、大理石紋、pH值、系水力及脂肪酸含量等方面均有不同程度的優勢[3]，地方豬和野豬豬肉產品在豬肉供應市場上占有一定的份額，并有逐步提高的趨勢，地方豬的養殖生產在逐步走向規?；?。

隨著地方豬和野豬生產的規?；?，疫病防控、繁殖、營養飼料等一些問題也逐漸暴露出來，特別是仔豬腹瀉率高、成活率低的問題比較突出。2010年，本研究團隊在與企業產學研合作過程中發現，即使在豬群健康狀況非常良好、飼料配方和飼料原料來源比較穩定時，野豬和地方豬仔豬腹瀉率也比較高，成為制約經濟效益的重要因素之一。本研究圍繞這一現象開展了相關調查和試驗研究，最終確定為營養性腹瀉，通過分子遺傳學方法探明了該腹瀉的發生原因，并開發出了相應的抗腹瀉飼料添加劑和分子輔助育種技術。

1 材料與方法

1.1 豬LCT基因的多態性及對基因表達的影響采取大白豬、長白豬、杜洛克、荷包豬、民豬、長白山野豬仔豬耳組織樣本，提取DNA，通過對乳糖酶（lactase,LCT）基因進行PCR擴增和DNA測序，獲得LCT基因5'非編碼區增強子和啟動子多態性位點[4]。通過單倍型雙熒光報告系統試驗，確定LCT多態性位點對基因表達的影響[5]。

1.2 LCT基因的多態性與仔豬營養性腹瀉的相關分析取荷包豬、民豬、長白山野豬腹瀉仔豬糞便，測定糞便乳糖和pH；取仔豬耳組織樣本，提取DNA，分析LCT基因多態性，并采用SPSS軟件包（version 17.0）分析該多態性與仔豬腹瀉的相關關系[6]。

1.3 抗仔豬營養性腹瀉飼料添加劑的篩選經挑選整齊的野豬和荷包豬仔豬（哺乳和攝入含乳制品仔豬料）135頭，隨機分為9個處理組，每組15頭，每組分3個重復。第1組為空白對照組，飼喂基礎日糧；第2組飼喂寡果糖—FOS（150 mg/kg）；第3組飼喂寡甘露糖—MOS（200 mg/kg）；第4組飼喂寡果糖（150 mg/kg）和寡甘露糖（200 mg/kg）；第5組飼喂檸檬酸—CA（800 mg/kg）；第6組飼喂寡果糖（150 mg/kg）、寡甘露糖（200 mg/kg）和檸檬酸（800 mg/kg）；第7組飼喂乳糖酶—LA（540 U/ kg）；第8組飼喂乳糖酶—LA（540 U/kg）和檸檬酸（800 mg/kg）；第9組飼喂乳糖酶（540 U/kg）、檸檬酸（800 mg/kg）、寡果糖（150 mg/kg）和寡甘露糖（200 mg/kg）。日糧參照NRC（1998）《豬營養需要》配制，試驗豬群飼喂粉料，自由飲水，試驗期42 d[7]。

2 結果與分析

2.1 豬LCT基因的多態性及對基因表達的影響通過PCR產物擴增后測序，發現豬LCT基因5'非編碼區增強子第-797位出現G或A的單核苷酸多態性；啟動子區第-308位為G或C的單核苷酸多態性；啟動子區第-301位為A或G的單核苷酸多態性。其中啟動子區-308位與-301位是對應的關系，即啟動子區-308位為G時，-301位為A；當啟動子區-308位為C時，-301位為G，因此構成單倍型GA和CG[6]。

通過雙熒光報告系統試驗發現，啟動子GA和CG相比差異極顯著。啟動子CG強烈促進基因表達，而GA不能促進基因表達。增強子A，對于啟動子GA來說，使啟動子GA活性顯著增強（P＜0.05）；對于啟動子CG來說，卻是抑制子，使啟動子CG活性極顯著降低（P＜0.01）。增強子G，無論是哪一種啟動子，均起極顯著的抑制作用（P＜0.01）。豬LCT增強子和啟動子多態性位點組合形成的單倍型促進基因表達的作用從高到低順序為：增強子A﹢啟動子GA＞增強子A/G﹢啟動子CG＞增強子G﹢啟動子GA[5-6]。

2.2 LCT基因的多態性與仔豬營養性腹瀉的相關分析采用SPSS軟件包（version 17.0）的統計模型分析基因型與乳糖不耐受性腹瀉的相關關系，結果表明，SNP G-797A的GG基因型、SNP G-308C和SNP A-301G的GAGA基因型分別與地方豬和野豬的乳糖不耐受性腹瀉顯著相關，其他基因型與野豬/地方豬或引進豬種中乳糖不耐受性腹瀉性狀相關不顯著[6]。

2.3 抗仔豬營養性腹瀉飼料添加劑的篩選試驗結果表明，所涉及到的4種添加劑具有相當好的協同性和互補性，是單一原料所不能替代的，見表1[7]。從試驗數據反映出，造成仔豬腹瀉是各種原因綜合作用的結果，其中營養性腹瀉是主要原因，消化道胃酸分泌不足、微生態平衡不佳是次要原因。4種成分針對仔豬腹瀉主次兼顧，因此聯合使用獲得較好的預防效果。

3 討論

本研究團隊在與以飼養野豬和地方豬為主的養豬企業產學研合作過程中，豬場提出哺乳仔豬腹瀉率高。針對這一問題，組織了專家對豬場進行了調查研究，包括豬場的防疫和歷史疫病發生情況、泌乳母豬的健康狀況、日糧/飼糧配方及飼料原料質量、豬場的生產管理等。與引進豬種相比，未發現引起仔豬腹瀉的誘因。受人類乳糖不耐受癥的啟發，測定了腹瀉仔豬的糞便，發現大多數腹瀉仔豬糞便中含未被消化吸收的乳糖，由此初步判斷仔豬可能由于乳糖酶（LCT）分泌不足而引起營養性腹瀉。本課題組通過生產試驗和實驗室兩方面研究確認其原因是小腸中消化乳汁乳糖的LCT缺乏所致，并由此建立了分子標記輔助選擇（marker assisted selection,MAS）育種技術，研制出有效的治療和預防仔豬腹瀉的飼料添加劑，獲得了2項國家授權發明專利[6-7]，形成抗野豬和地方豬仔豬營養性腹瀉的綜合配套技術。

表1 添加劑抗地方豬仔豬腹瀉的效果分析Table1 The effect of the additives of local pig diarrhea piglets analysis

3.1 仔豬LCT基因的分子標記輔助育種根據2.1和2.2的試驗結果，在進行地方豬或野豬的純繁、以及地方豬或野豬與引進豬種的雜交育種過程中，通過分子標記輔助選擇（MAS），淘汰SNP G-797A的GG基因型或SNP G-308C和SNP A-301G的 GAGA基因型或單倍型GAGA個體，可以避免后代出現仔豬營養性腹瀉，顯著提高豬群仔豬消化乳糖能力，減少由于LCT缺乏引起的仔豬腹瀉，降低仔豬死亡率。

3.2 抗腹瀉飼料添加劑的應用本研究所篩選的添加劑具有4方面優點：①可以降低仔豬的腹瀉率。哺乳和攝入含乳制品仔豬料的野豬及地方豬仔豬腹瀉率降低80%以上，健康狀況得到顯著改善。②可以提高仔豬成活率。由于有效抑制了腹瀉，仔豬的采食量增加，疾病發生率顯著降低，因而成活率明顯提高。③可以提高日增重。由于健康狀況得到改善，采食量增加，使仔豬日增重顯著提高，不僅提高了仔豬階段的日增重，也對后期生長肥育階段的日增重有一定作用。④本飼料添加劑不影響食品安全，無環境污染。所用產品包括安全、高效的酶制劑，來源于天然原料的寡果糖和寡甘露糖，廣泛應用于食品生產的檸檬酸，因此本產品不會影響生豬食品安全，也不會帶來環境污染，更不會產生耐藥性等問題，是安全、高效、環保的飼料添加劑。

3.3 進一步的工作本研究所形成的抗野豬和地方豬仔豬營養性腹瀉綜合技術如果能夠大范圍推廣應用，可以使野豬和地方豬飼養成本顯著降低，保障養豬企業經濟效益，有利于擴大野豬和地方豬飼養規模和產業化水平，進一步調動農民利用自然資源飼養野豬和地方豬的積極性，有利于和諧社會的建設和發展。

[1]陳瓊，王濟民.我國肉類消費現狀與未來發展趨勢[J].中國食物與營養，2013（6）：43-47.

[2]楊紅杰，彭華，王林云.從我國豬肉消費趨勢展望地方豬種發展前景[J].中國畜牧雜志，2014，50（16）：6-10.

[3]薛尚軍，楊曉奮，劉宏，等.中國地方豬種的肉質特性[J].國外畜牧學-豬與禽，2011，30（2）：92-94.

[4]杜海廷，趙薇，巴彩鳳，等.豬乳糖酶基因5'非編碼區多態性分析[J].畜牧與獸醫，2013，45（8）：35-49.

[5]Du H T,Zhu H Y,Wang J M,et al.Single-nucleotide polymorphisms and activity analysis of the promoter and enhancer of the pig lactase gene[J].Gene,2014,545(1):56-60.

[6]遼寧醫學院，蘇玉虹，田玉民，杜海廷，等.仔豬乳糖消化性狀的LCT基因多態性檢測方法及其應用[P].中國：201310339704.3，2013-10-23.

[7]遼寧醫學院，田玉民，蘇玉虹.抗野豬和地方豬仔豬腹瀉的飼料添加劑[P].中國：201110413894.3，2012-04-18.

（編輯：郭雪峰）

Research on Decrease of Nutritional Diarrhea in Boar and Local Piglets

Tian Yumin,Su Yuhong,Wang Yubin,Gao Qun,Zhang Huijun,Wang Tieliang

（Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou121001）

High nutritional diarrhea rate in boar and local piglets affected the economic benefits seriously.In this study,the polymorphism loci of pig lactase(LCT)at 5'non-coding enhancer and promoter was detected by PCR and DNA sequencing.And confirmed the regulating genes expression ofLCT polymorphic loci through a experiment with dual luciferase report system.The correlation was significant between the polymorphism of LCT and piglets lactose digestive traits with statistical analysis.Then selected the anti-diarrheal feed additive by feeding trials.The study above formed an integrated technology for controlling nutritional diarrhea in boar and local piglets and laid the foundation for the subsequent application.

Boar Piglet;Local Piglet;Nutritional Diarrhea;Lactase;Feed Additive

S828.4文獻標識碼：B文章編號：1672-9692(2015)02-0019-04

2015-01-11

田玉民（1962-），男，碩士，教授，碩士生導師，研究方向為飼料資源開發與利用。

遼寧省高等學校優秀人才支持計劃一層次項目(LR2013042)