土壤中產廣譜抗菌肽菌株的篩選及鑒定

唐峰，李哲，王鐵良，唐雨順，劉永華，寇敘，劉秀萍?

（1.遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001；2.天津市津南區畜牧水產發展服務中心，天津300350）

土壤中產廣譜抗菌肽菌株的篩選及鑒定

唐峰1，李哲2，王鐵良1，唐雨順1，劉永華1，寇敘1，劉秀萍1?

（1.遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001；2.天津市津南區畜牧水產發展服務中心，天津300350）

用雙層平板法從土壤中分離到4株具有廣譜抑菌活性的菌株，利用瓊脂擴散法測定其對鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌、福氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌的抑菌能力，篩選其中抑菌能力最強的菌株命名為JZ4。菌液上清分別經過鹽析、透析或與蛋白酶作用后測定其抑菌能力，發現該抑菌物質中含有肽類物質。經16S rDNA序列比對，初步鑒定其為側孢短芽孢桿菌。

土壤；抗菌肽；抑菌；側孢短芽孢桿菌

抗菌肽也稱抗微生物肽，是生物體固有免疫系統的重要組成部分?？咕牟粌H具有抗細菌的活性，而且具有抗真菌、抗寄生蟲、腫瘤的活性[1]。使用抗菌肽作為飼料添加劑代替抗生素已成為飼料學科的研究熱點。與動物抗菌肽和植物抗菌肽相比，細菌抗菌肽提取容易、生產周期短。但是，目前開發利用的細菌抗菌肽為數較少。本試驗通過篩選所獲得的抗菌肽具有廣譜抗菌能力，對常見病原菌具有較好的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品采自錦州市8個飼料廠的土壤，共24份。

1.1.2 指示菌鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌、福氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉（本實驗室保存）。

1.1.3 培養基營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.4 引物27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492-r：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

1.2 方法

1.2.1 產抑菌物質菌株的分離、純化采用雙層平板法[2]。將土壤做梯度稀釋，取0.5 mL懸濁液加入到已接種金黃色葡萄球菌的營養瓊脂培養基中，再加入45℃營養瓊脂培養基，混勻。25℃培養。挑取產生抑菌圈的菌落，進行純化。

1.2.2 產抑菌物質菌株的篩選分別以鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌、福氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉為指示菌，用生理鹽水稀釋至OD600=0.2，與營養瓊脂培養基混勻制成指示平板。將產抑菌物質菌株接種至營養肉湯培養基，25℃200 r/min培養24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清。采用瓊脂打孔擴散法測定上清的抑菌效果。

1.2.3 抑菌物質的初步鑒定對抑菌能力較強菌株產生的抑菌物質成分進行鑒定。①有機酸堿作用的排除：比較培養24 h后的營養肉湯培養基與接種前的營養肉湯培養基的pH，判斷是否產生有機酸堿。②鹽析后抑菌活性測定：用65%的硫酸銨對4 mL菌液上清進行鹽析，用磷酸鹽緩沖液溶解沉淀后，進行抑菌活性測定。③透析后抑菌活性測定：用透析袋（8～14 kD）對4 mL菌液上清進行透析，用PEG 20000濃縮，濃縮液用磷酸鹽緩沖液調整至4 mL，進行抑菌活性測定。④蛋白酶處理后菌活性測定：將0.4 mL菌液上清加到終濃度為l mg/mL的蛋白酶K或胃蛋白酶中，調整蛋白酶K的pH=7.0，胃蛋白酶pH=2～3，37℃水浴4 h，進行抑菌活性測定。

1.2.416 S rDNA序列分析利用通用引物27f、1492r擴增純化后的菌液，將PCR產物測序。測序結果在GenBank中比對。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選24份土壤中，得到4株具有明顯抑菌能力的菌株，分別命名為JZ1、JZ2、JZ3、JZ4。其中JZ4的抑菌能力最強?？咕V見表1。

表1 不同菌株的抑菌環直徑Table1 Differences in the bacteriostatic ring diametermm

2.2 抑菌物質的初步鑒定JZ4培養24 h后的菌液上清pH=7.5，與培養基自身的pH未見明顯區別。所以，JZ4的抑菌能力不是由有機酸或堿產生的。菌液經鹽析、透析以及蛋白酶處理后抑菌環直徑如表2所示。其中，經鹽析后的蛋白粗提液抑菌圈大于鹽析前菌液的抑菌圈。菌液經透析后，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈未見明顯變化。菌液對胃蛋白酶有一定敏感性，抑菌能力有所下降。綜合以上結果，可以初步判斷該菌液的抑菌物質含有肽類物質或蛋白質。

表2 JZ4菌株經不同處理后對金黃色葡萄球菌的抑菌環直徑Table2 Bacteriostatic ring diameter after different treatment of JZ4

2.3 測序結果菌株JZ4的16S rDNA序列與Brevibacillus laterosporus strain BL-1同源性為99%。利用DNAMan軟件構建系統進化樹，如圖1所示。菌株JZ4在親緣關系上與側孢短芽孢桿菌屬非常相近，初步鑒定為側孢短芽孢桿菌。

3 討論

圖1 菌株JZ4系統進化樹Fig.1 Phyletic evolution tree of JZ4

抗菌肽的來源可以分為4大類，即昆蟲、動物、微生物及人工合成。已有報道的抗菌肽總量多達1 500種[3]，其中，從土壤微生物中分離得到的抗菌肽報道較少。土壤中微生物種類復雜，來源豐富，因此土壤是篩選分泌抗菌肽菌株的理想來源。研究表明，飼糧中添加抗菌肽能抑制病菌繁殖，通過改善動物腸道菌群結構[4]，促進動物健康[5]并提高生產性能[6]。與目前飼料中廣泛使用的獸藥相比，抗菌肽不會在動物性食品中殘留，不易產生細菌耐藥性[7]。因此，抗菌肽有望替代獸藥，成為新型飼料添加劑，并已展現出誘人的前景[8-9]。由于抗菌肽生產成本較高，因此限制了抗菌肽在生產中的應用。利用基因工程菌異源表達抗菌肽是一種新模式。利用大腸桿菌表達系統[10]、畢赤酵母表達系統[11]表達抗菌肽的報道陸續出現。本研究組計劃在獲得分泌抗菌肽菌株的基礎上，純化抗菌肽并進一步研究其抗菌活性和理化性質，并利用基因工程菌異源表達該抗菌肽。

[1]李冠楠，夏雪娟，隆耀航，等.抗菌肽的研究進展及其應用[J].動物營養學報，2014，26（1）：17-25.

[2]劇建格.高效廣譜抗菌肽產生菌的篩選及發酵條件的研究[D].保定：河北農業大學，2009.

[3]GUANI-GUERRA E,SANTOS-MENDOZA T,LUGO-REYES Saúl O,et al.Antimicrobial peptides:general overview and clinical implications in human health and disease[J].Clinical Immunology,2010,135(1):17-11.

[4]侯振平，印遇龍，王文杰，等.乳鐵蛋白素B和天蠶素P1對投喂大腸桿菌斷奶仔豬生長及腸道微生物區系的影響[J].動物營養學報，2011，23（9）：15367-1544.

[5]呂尊周，袁肖笑，蔡兆偉，等.抗菌肽對蛋雞血清免疫指標及脾臟白細胞介素2 mRNA表達量的影響[J].動物營養學報，2011，23（12）：21837-22189.

[6]陳香，譙仕彥，李波，等.添加天蠶素抗菌肽對斷奶仔豬生長性能的影響[J].中國飼料，2011（12）：257-30.

[7]Philip A Thacker.Alternatives to antibiotics as growth promoters for use in swine production:areview[J].JournalofAnimalScienceandBiotechnology,2013,4(35):1157-126.

[8]汲全柱，任靜柏.抗菌肽的研究進展[J].現代畜牧獸醫，2010，（4）：647-66.

[9]邱富娜，劉金娥，馬俊，等.綠色飼料添加劑抗菌肽研究進展[J].畜牧與飼料科學，2013，34（2）：27-28.

[10]陳玉海，陳慶煌，陳科，等.抗菌肽magaininⅡ的密碼子優化及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達[J].生物工程學報，2014，30（4）：6157-624.

[11]孫長峰，仲維霞，王洪法，等.雜合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在畢赤酵母中的分泌表達及活性鑒定[J].中國病原生物學雜志，2014，9（2）：1727-1736.

（編輯：張婷婷）

Identification and Screening of Broad-spectrum Antibiotics-producing Strains from Soil

Tang Feng1,Li Zhe2,Wang Tieliang1,Tang Yushun1, Liu Yonghua1,Kou Xu1,Liu Xiuping1*

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou 121001; 2.Jinnan Develop and Service Center of Animal Husbandry and Aquaculture,Tianjin300350)

In this study,4 strains with broad-spectrum antibacterial activitywere isolated from soil with double-plate method,and the inhibition activity against Salmonella typhimurium,E. coli,Shigella,Staphylococcus aureus,and Aspergillus niger were determined by agar diffusion method.1 strain named JZ4 with greater inhibition zone was identified.Salting-out,dialysis and protease experiment were carried out and then preliminary determined that the antibiotics were antibacterial peptide.According to the sequence of 16S rDNA,strain JZ4 were identified as Brevibacillus laterosporus.

Soil;Antibacterial peptide;Inhibition activityl;Brevibacillus laterosporus

S852.6文獻標識碼：B文章編號：1672-9692(2015)02-0011-04

2014-11-14

唐峰（1980-），男，博士，副教授，主要從事動物防疫檢疫方向的研究。

劉秀萍（1963-），女，本科，副教授，主要從事動物性食品檢疫檢驗方向的研究。

遼寧醫學院橫向課題（LYHX2012076）、遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2012306）、遼寧省科技廳自然科學基金（聯合基金）項目（2013022041）