MMP- 3對大鼠牙髓損傷后修復性牙本質形成的促進作用及意義

李 雯, 尹 碩, 張 娟, 王 賀, 劉繼明, 羅 瑩, 李正強, 張穎麗

(吉林 長春 130021: 1.吉林大學口腔醫院; 2 .長春市中醫院)

·基礎研究·

MMP- 3對大鼠牙髓損傷后修復性牙本質形成的促進作用及意義

李 雯1, 尹 碩1, 張 娟1, 王 賀1, 劉繼明1, 羅 瑩2, 李正強1, 張穎麗1

(吉林 長春 130021: 1.吉林大學口腔醫院; 2 .長春市中醫院)

目的: 研究基質金屬蛋白酶3(MMP- 3)對牙髓損傷后修復性牙本質形成的作用。方法：取48只Wistar大鼠，分為3組(n=16)；在各組大鼠的左側上頜第一磨牙牙合面備洞至露髓后，分別用PBS、氫氧化鈣、MMP- 3(均以膠原蛋白海綿做載體)蓋髓。于術后3、7、14、28d各時間點，每組各隨機處死4只動物，制備實驗牙組織切片；HE和免疫組化染色，觀察各組修復性牙本質形成及成牙本質細胞中DMP- 1的表達情況。結果：MMP- 3組在蓋髓后DMP-1的表達情況: 3d時，呈弱陽性表達；7d時，呈陽性表達，露髓點下方可見散在的骨樣牙本質；14d時， 呈強陽性表達，露髓點下方可見連續完整的鈣化橋；28d時，表達明顯減弱，露髓點下方可見大量修復性牙本質。各時間點各組成牙本質細胞中DMP- 1陽性區的灰度值均以MMP- 3組最高，PBS組最低;MMP- 3組與PBS組相比，在術后3、7、14d時均有顯著性差異(P<0.05)；MMP- 3組與氫氧化鈣組相比，在術后3、7d時有顯著性差異(P<0.05)。結論：MMP- 3對牙髓損傷后修復性牙本質的形成具有促進作用。

基質金屬蛋白酶3; 牙髓; 損傷修復; 成牙本質細胞

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):453]

牙本質基質蛋白-1(DMP- 1)是一種酸性磷酸化的細胞外基質蛋白，是礦化組織中非膠原蛋白的重要組成部分，在牙齒中主要表達于分泌型成熟的成牙本質細胞[1]，也是成牙本質細胞的特異性蛋白。牙髓組織在受到外界各種刺激(如外傷、放射線、化學藥物、備洞時的機械力等)時，會出現一系列的反應以抵御刺激并進行自身修復[2-5]。在形成修復性牙本質的過程中，成牙本質細胞分泌活動的調節和成牙本質細胞樣細胞的分化對損傷后牙髓的修復起著極其重要的作用[6]。有研究表明[7]，DMP- 1在深齲的成牙本質細胞樣細胞胞漿和修復性牙本質中均呈強陽性表達，說明DMP- 1參與了牙髓的自身修復過程，并能反映牙髓損傷后硬組織的修復性再生情況。

近年來，研究較多的基質金屬蛋白酶3(Matrix metalloproteinase 3 ，MMP- 3)是基質金屬蛋白酶家族的重要成員, 其能降解多種細胞外基質成分,不僅參與組織形態發生、損傷修復、炎癥反應等一系列生理、病理過程；還在風濕性關節炎[8]、動脈粥樣硬化[9]、乳腺癌[10]等疾病和腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。已有體外實驗[11]證明，MMP- 3在成熟牙齒的礦化牙本質中呈高表達，所以大膽猜想 MMP- 3可能參與了硬組織的礦化過程。

目前關于MMP- 3對牙髓損傷修復效果的研究甚少。本實驗在構建大鼠牙髓機械性損傷的基礎上建立模型，分別將 MMP- 3、氫氧化鈣、PBS置于損傷牙髓斷面；然后以DMP- 1作為修復性牙本質形成的特異性標志物[12]，分別觀察不同蓋髓劑蓋髓后成牙本質細胞中DMP- 1的表達情況，以期探討MMP- 3對修復性牙本質形成的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

清潔級雄性Wistar大鼠(吉林大學實驗動物中心提供)；1/4鎢鋼球鉆、高速渦輪機(上海醫用器械設備廠)；30 g/L水合氯醛、乙醚(長春市永輝化工商貿有限公司)；膠原蛋白海綿(吉林大學口腔頜面外科提供)；基質金屬蛋白酶3(Sigmag公司，美國)；氫氧化鈣(登士柏，日本)；DMP- 1 單克隆抗體、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)；富士Ⅸ玻璃離子(吉林大學口腔醫院提供 )；顯微鏡和照相系統(OLYMPUS, BX71，日本)。

1.2 實驗動物分組及蓋髓處理

1.2.1 實驗動物的選擇和分組

取8周齡健康雄性Wistar大鼠48只(體質量180～220 g)，所有大鼠牙體、牙列完整，咬合關系正常，無齲病、牙周病及牙齒畸形；用軟硬混合飼料適應性飼養兩周后，按不同蓋髓劑隨機分為3大組(n=16)：陰性對照組(PBS蓋髓)、陽性對照組(氫氧化鈣蓋髓)、實驗組(MMP- 3蓋髓), 每組大鼠再根據觀察時間各隨機分為3、7、14、28 d 4個亞組(n=4)。

1.2.2 牙髓損傷模型的制備及蓋髓處理

上述各組Wistar大鼠稱重后，用30 g/L水合氯醛肌肉注射(3 mL/kg)進行麻醉。然后將各大鼠仰臥位固定于手術板上，20 g/L碘伏消毒口腔后，用1/4球鉆分別在每只大鼠的左側上頜第一磨牙牙合面中央制洞，當出現細小穿髓點時立即停止；用生理鹽水充分沖洗，無菌棉球壓迫止血并干燥窩洞后，按分組進行蓋髓：實驗組露髓處放置含MMP- 3(100 μg/μL)的膠原蛋白海綿; 陰性對照組露髓處放置含PBS(100 μg/μL)緩沖液的膠原蛋白海綿; 陽性對照組露髓處放置含氫氧化鈣糊劑(100 μg/μL)的膠原蛋白海綿，最后用玻璃離子(富士Ⅸ)充填窩洞。以上所有操作均由一名臨床經驗豐富的醫生單獨完成。

1.3 取材及組織切片制備

所有大鼠分別于蓋髓術后3、7、14、28 d用40 g/L多聚甲醛心內注處死后，迅速分離各大鼠的上頜骨并制備包含左側上頜第一磨牙的骨組織塊。然后將各組骨組織塊置于新配置的40 g/L多聚甲醛中，常溫固定48 h后置于100 g/L EDTA(pH=7.4)溶液中脫鈣8周；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋后，平行于牙體長軸方向做近、遠中向連續切片(厚5 μm)。最后選取各組通過穿髓孔的組織切片用于以下觀察。

1.4 HE染色觀察

取上述各組組織切片常規脫蠟至水，分別經蘇木素染色5 min、流水返藍15 min、伊紅染色3 min、流水沖洗5 min后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；然后在顯微鏡下觀察各組修復性牙本質的形成情況并采集圖像。

1.5 免疫組化染色觀察

取上述各組組織切片脫蠟至水，用PBS 洗滌并

擦干組織周圍的多余水分后，浸入新鮮配置的30 mL/L過氧化氫液中室溫孵育10 min以滅活內源性的過氧化氫酶； 0.1 mol/L PBS洗滌5 min×3次，滴加正常非免疫動物血清封閉 30 min；甩去多余液體,不洗，滴加稀釋的DMP- 1單克隆抗體 (1 ∶200)， 4 ℃ 濕盒過夜；次日37 ℃復溫45 min，0.1 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加生物素化二抗IgG(山羊抗兔)孵育20 min； 0.1 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)孵育20 min； 0.1 mol/L PBS洗5 min×3次，DAB顯色后，蘇木精輕度復染胞核1～3 min；流水沖洗，梯度乙醇水化后，二甲苯透明(5～10 min)、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察DMP- 1表達情況并照相。同時，在高倍鏡下從每張切片的染色陽性區各隨機選取3個不重疊區域，用Image- Pro Plus軟件測其陽性灰度值，并取均值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 HE染色觀察結果

PBS組：蓋髓后3 d時，露髓點下方有大量炎細胞聚集(較MMP- 3組炎癥反應重)，呈化膿性征兆(圖1a)；7 d時，炎癥細胞數量進一步增多，可見少量前期牙本質形成(圖1b)；14 d時，露髓點下方炎細胞密集，可見前期牙本質不均勻增厚而形成的少量修復性牙本質(圖1c)；28 d時，可見髓室內的牙髓呈變性壞死征兆 (圖1d)。

a.術后3d,炎癥反應明顯,成牙本質樣細胞活躍b.術后7d,露髓點下方大量炎細胞聚集,成牙本質細胞排列紊亂,有前期牙本質形成c.術后14d,穿髓孔下方仍有大量炎細胞聚集,可見前期牙本質增厚而形成的修復性牙本質d.術后28d,前期牙本質增厚而形成的少量修復性牙本質,髓腔中有局限的液化變性壞死灶

圖1 蓋髓術后不同時間點PBS組大鼠的牙髓組織學觀察(#示前期牙本質, *示修復性牙本質; HE染色)

氫氧化鈣組：蓋髓后3 d時，露髓點下方可見大量炎細胞及明顯擴張的血管(圖2a)；7 d時，穿髓孔下方的炎細胞和擴張的血管數目進一步增多(圖2b)；14 d時，可見少量不連續的鈣化橋形成，并可見牙髓呈壞死征兆(圖2c)；28 d時，牙髓鈣化壞死(圖2d)。

MMP- 3組：蓋髓后3 d時，露髓點下方有少量炎細胞聚集，并可見明顯擴張的血管及新生血管(圖3a)；7 d時，炎癥和血管擴張明顯，露髓點下方可見少量前期牙本質及散在的骨樣牙本質(圖3b)；14 d時，穿髓孔下方可見連續完整的鈣化橋形成,無明顯炎細胞浸潤(圖3c)；28 d時，露髓點下方可見大量修復性牙本質，無明顯炎細胞浸潤(圖3d)。

2.2 DMP- 1免疫組化染色觀察結果

PBS組：蓋髓后3 d時，穿髓孔下方的成牙本質細胞幾乎無陽性表達(圖4a)；7 d時呈弱陽性表達(圖4b)；14 d時呈陽性表達，但其強度較MMP- 3 組和氫氧化鈣組弱(圖4c)；28 d時穿髓孔下方的成牙本質細胞幾乎無陽性表達(圖4d)。

氫氧化鈣組：蓋髓后3 d時，穿髓孔下方的成牙本質細胞呈弱陽性表達(圖5a)；7 d時呈陽性表達(圖5b)；14 d時呈強陽性表達，且其表達強度介于PBS組和MMP- 3組之間(圖5c)；28 d時呈弱陽性表達(圖5d)。

MMP- 3組：蓋髓后3 d時，穿髓孔下方的成牙本質細胞呈弱陽性表達(圖6a)；7 d時呈陽性表達(圖6b)；14 d時呈強陽性表達(圖6c)；28 d時呈弱陽性表達(圖6d)。

各組DMP- 1染色陽性區的灰度值分析結果顯示：蓋髓后3、7、14、28 d各時間點，各組灰度值由高至低依次為MMP- 3組、氫氧化鈣組、PBS組；MMP- 3組與PBS組灰度值相比，術后3、7、14 d各時間點均有統計學差異(P<0.05), 術后28 d時差異無統計學意義(P>0.05)；MMP- 3組與氫氧化鈣組相比，術后3、7 d各時間點，兩者的灰度值均有統計學差異(P<0.05)，術后14、28 d各時間點，兩者的灰度值差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

a.術后3d,炎癥反應明顯,血管擴張b.術后7d,露髓點下方有大量炎細胞聚集,擴張血管數目增多c.術后14d,穿髓孔下方形成不連續鈣化橋,可見牙髓呈壞死征兆 d.術后28d,牙髓鈣化壞死

圖2 蓋髓術后不同時間點氫氧化鈣組大鼠的牙髓組織學觀察(#示擴張血管, *示修復性牙本質; HE染色)

a.術后3d,炎癥反應較輕,可見新生血管,成牙本質細胞排列正常b.術后7d,血管擴張,成牙本質細胞活躍,露髓點下方見前期牙本質形成及散在的骨樣牙本質c.術后14d,成牙本質細胞增生活躍,炎癥反應減輕,露髓點下方有連續的鈣化橋形成d.術后28d,成牙本質細胞活躍程度減弱,露髓點下方已形成大量修復性牙本質

圖3 蓋髓術后不同時間點MMP- 3組大鼠的牙髓組織學觀察(#示新生血管, *示修復性牙本質; HE染色)

a.術后3d,幾乎無陽性表達 b.術后7d,呈弱陽性表達c.術后14d,呈陽性表達,弱于實驗組d.術后28d,幾乎無陽性表達

圖4 蓋髓術后不同時間點PBS組DMP- 1免疫組化染色 (#示成牙本質細胞)

a.術后3d,呈弱陽性表達b.術后7d,呈陽性表達c.術后14d,呈強陽性表達d.術后28d,呈弱陽性表達

圖5 蓋髓術后不同時間點氫氧化鈣組DMP- 1免疫組化染色 (#示成牙本質細胞)

a.術后3d,呈弱陽性表達b.術后7d,呈陽性表達c.術后14d,呈強陽性表達d.術后28d,呈弱陽性表達

圖6 蓋髓術后不同時間點MMP- 3組DMP- 1免疫組化染色 (#示成牙本質細胞)

*與PBS組相比P<0.05；#與氫氧化鈣組相比P<0.05

3 討論

牙髓組織的自身修復是很復雜的過程，而且取決于炎癥的程度及其他相關因素。炎癥較重時，一方面，未分化的牙髓干細胞向損傷處遷移并分化為成牙本質細胞樣細胞來抵抗外界刺激[13]；另一方面，牙髓組織中的一些細胞外基質蛋白如牙本質涎磷蛋白(DSPP)、基質金屬蛋白酶(MMPs)和細胞因子如轉化生長因子β(TGF- β)、胰島素樣生長因子1(IGF- 1)等可通過自身的調節作用來參與牙髓組織的修復[14]。而且有研究證明，成牙本質細胞樣細胞通過分泌基質蛋白形成修復性牙本質是牙髓損傷修復的關鍵環節[15-16]。近年來，關于牙髓受損后的保髓治療已成為備受關注的牙髓治療方法，即在牙髓的創傷面上放置保護性材料，可使牙髓-修復體界面形成連續的牙本質橋，并最終形成修復性牙本質。MMPs是一類在細胞外基質的生理性和病理性降解過程中起重要作用的蛋白酶超家族，它廣泛存在于各結締組織中，并與多種疾病的發生有著緊密的聯系[17-19]。在病理條件下，MMP- 3不僅可降解細胞外基質，還可通過誘導細胞的增殖、遷移而完成組織的重建過程[20-21]，是參與機體損傷組織修復的重要因子。

本實驗首次將MMP- 3作為蓋髓劑用于大鼠牙髓損傷的蓋髓治療，并以PBS、氫氧化鈣作為對照，分別觀察不同蓋髓劑蓋髓后成牙本質細胞中DMP- 1的表達情況，以探討MMP- 3對修復性牙本質的形成作用。HE染色結果顯示：PBS組牙髓組織炎癥反應從3 d開始就較明顯，蓋髓后期(14 d)僅有少量修復性牙本質形成，但依然可見一定范圍內的炎細胞浸潤及牙髓壞死征兆。氫氧化鈣組在蓋髓初期的牙髓炎癥反應亦較重，14 d時髓腔逐漸縮小并形成不連續的鈣化橋，雖然氫氧化鈣的強堿性可以中和牙髓炎癥產生的酸性物質[22]，但在28 d時牙髓組織仍出現了凝固性變性壞死。而MMP- 3組在蓋髓后3 d時，其牙髓組織的炎癥反應即較PBS組和氫氧化鈣組輕，并可見新生血管的形成，從而證實了MMP- 3在牙髓損傷修復過程中可以促進血管再生的說法[23]；從7 d開始，前期牙本質逐漸增厚而形成連續的鈣化橋，并最終形成明顯的修復性牙本質。有學者通過建立成年大鼠輕度牙髓損傷修復模型證實，當牙髓的炎癥局限于露髓點下方較小范圍時， MMP- 3有一定的抗炎作用[24]。結合本實驗中MMP- 3可以促進血管再生和修復性牙本質形成的結果, 提示MMP- 3是一種良好的蓋髓劑。免疫組化染色結果顯示，DMP- 1在MMP- 3組成牙本質細胞中的陽性表達從第3天開始出現，隨后逐漸增強并于蓋髓后第14天達到最高峰， 28 d時陽性表達明顯減弱。蓋髓術后各時間，各組成牙本質細胞中DMP- 1表達陽性區的平均灰度值均以MMP- 3組最高，PBS組最低。MMP- 3組與PBS組相比，在術后3、7、14 d時具有顯著性差異(P<0.05)；MMP- 3組與氫氧化鈣組相比，在術后3、7 d時具有顯著性差異(P<0.05)。以上結果說明，MMP- 3在炎癥初期和中期可增強成牙本質細胞和牙髓細胞的活躍性，使之在受到外界刺激時可通過分泌DMP- 1而逐漸形成修復性牙本質；28 d時成牙本質細胞活躍程度降低，其分泌的DMP- 1也相應減少，所以DMP- 1的陽性表達也減弱。

綜上所述，將 MMP- 3置于損傷牙髓的露髓處，對增強成牙本質細胞的活躍性和提高修復性牙本質的形成能力均有一定的促進作用，證實了Biochem等[25]報道的MMP- 3可誘導炎癥牙髓細胞的生長、分化、遷移和礦化這一實驗結論。本結果提示，基質金屬蛋白酶-3(MMP- 3)是一種良好的蓋髓劑，可與氫氧化鈣等蓋髓劑聯合應用于臨床，為開發新的蓋髓劑提供了理論基礎和新思路。

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Effects of MMP-3 on the reparative dentin formation in rats after dental pulp injury

LI Wen*, YIN Shuo, ZHANG Juan, WANG He, LIU Ji- ming , LUO Ying, LI Zheng- qiang , ZHANG Ying- li

(*DepartmentofEndodontics,SchoolofStomatology,JilinUniversity,Changchun130021,China)

AIM: To study the role of MMP- 3 on the reparative dentin formation after pulp injury. METHODS: 48 Wistar rats were divided into 3 groups(n=16). A cavity on the occlusal surface of maxillary first molars on left side was prepared in each rat, PBS, calcium hydroxide, and MMP-3 was applied on the exposed pulp in the rats of the 3 groups respectively. On day 3, 7, 14 and 28 after operation, the rats were sacrificed. The tooth were stained with HE and immunohistochemistry.DMP- 1 expression was observed. RESULTS: In MMP- 3 group, DMP- 1 was weakly expressed on d 3, positively expressed on d 7 and strongly expressed on d 14, but its expression decreased on d 28 in odontoblasts. A large number of scattered osteoid dentin was observed under the exposed pulp on d 7. Continuous calcified bridge was observed under the exposed pulp on d 14 . A thick layer of reparative dentin was observed under the exposed pulp, MMP- 3 group showed stronger DMP- 1exoression(P<0.05) and more reparative dentin than PBS group at each time point, and than calcium hydroxide group on d 3 and d 5. CONCLUSION: MMP- 3 may promote the repair of dental pulp after injury.

matrix metalloproteinase 3(MMP-3); dental pulp; wound healing; odontoblas

2015-01-07

吉林省科技發展計劃(20130102096JC)

李 雯(1989-)，女，漢族，山西長治人。碩士生(導師：張穎麗)

張穎麗，E-mail：zhangyingli1989@163.com

R

A

1005-2593(2015)08-0453-07

長春市科技計劃項目 (12SF88)