氫氟酸酸蝕形成的兩種不同微/納米表面對骨髓間充質干細胞生物活性的影響

申明明, 李艷榮, 齊亞平, 付 亁, 秦東澤, 梁建飛, 趙云轉

(1. 河北醫科大學第二醫院口腔頜面外科, 河北 石家莊 050000; 2. 解放軍總醫院內分泌科一病區, 北京 100853; 3. 軍事口腔醫學國家重點實驗室,陜西省口腔醫學重點實驗室, 第四軍醫大學口腔醫院, 陜西 西安 710032)

氫氟酸酸蝕形成的兩種不同微/納米表面對骨髓間充質干細胞生物活性的影響

申明明1, 李艷榮2, 齊亞平1, 付 亁3, 秦東澤3, 梁建飛3, 趙云轉1

(1. 河北醫科大學第二醫院口腔頜面外科, 河北 石家莊 050000; 2. 解放軍總醫院內分泌科一病區, 北京 100853; 3. 軍事口腔醫學國家重點實驗室,陜西省口腔醫學重點實驗室, 第四軍醫大學口腔醫院, 陜西 西安 710032)

目的: 評價純鈦樣品經12.5 g/L氫氟酸(HF)酸蝕處理不同時間后形成的兩種不同表面對骨髓間充質干細胞(BMMSCs)生物活性的影響。方法：將純鈦鈦片平均分為3組：A組拋光處理；B組12.5 g/L HF酸蝕1 min；C組12.5 g/L HF酸蝕15 min。X射線能譜儀分析(EDS)其表面化學成分；親水性試驗測量樣品表面的接觸角；激光共聚焦顯微鏡計數評價BMMSCs在樣品表面的早期黏附；SEM觀察觀察樣品表面形貌及黏附的細胞形態；MTT法檢測細胞活性；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒測定ALP活性。結果：酸蝕后的兩組樣品都可形成微/納米級表面形貌且載入氟元素；酸蝕后的表面接觸角明顯小于拋光組，且C組小于B組；酸蝕后的純鈦樣品表面能夠促進BMMSCs的黏附、增殖和ALP活性，且C組優于B組。結論：HF酸蝕使純鈦表面構建了不同結構的微/納米形貌，載入了氟元素，可促進BMMSCs在純鈦表面的生物活性。

氫氟酸(HF); 酸蝕; 微/納米; 表面處理; 生物活性

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8): 472]

隨著口腔種植學的飛速發展，種植牙在臨床上受到了患者和醫生的普遍歡迎。然而，口腔種植仍面臨著治療周期過長、骨質骨量不佳、種植成功率低等問題。目前認為，種植體的成功率主要取決于種植體與周圍骨組織的結合，為提高種植體骨結合效果，縮短骨結合時間，學者們嘗試了很多方法，其中對種植體進行表面處理被認為是促進種植體骨結合最有效的方法之一。種植體表面處理的方法有很多種，其中酸蝕法因其操作簡單、設備低廉等原因，一直廣受關注。目前常用的酸有HCl、HNO3等，由于在酸蝕的同時可載入具有促成骨作用的氟元素，使得氫氟酸(HF)成為目前對種植體進行表面處理的研究熱點。然而現有的研究對于HF酸蝕的濃度和作用時間無較精確的標準，加之酸蝕后的表面形貌不能夠較精確地控制，所以本實驗通過應用12.5 g/L HF對鈦片酸蝕不同時間，對其形成的表面形貌及其對BMMSCs生物活性的影響進行研究，以期為HF進一步應用于臨床提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 樣品制備和分組處理

取純鈦片(Φ14 mm×0.5 mm，西安中邦生物鈦有限公司)用#200、#800、#1 200、#2 000、#3 000、#5 000水相砂紙依序打磨拋光，再依次用丙酮、無水乙醇及去離子水分別超聲清洗15 min。然后將鈦片樣品隨機分為A、B、C 3組，其中A組樣品不予任何處理；B組樣品置于12.5 g/L HF中酸蝕1 min(30 ℃，200 r/min)、C組樣品置于12.5 g/L HF中酸蝕15 min(30 ℃，200 r/min)，并于酸蝕完成后，將B、C兩組鈦片依次用丙酮、無水乙醇及去離子水分別超聲清洗15 min。上述所有樣品分別經鈷60消毒后備用。

1.2 樣品表面形貌觀察及化學成分檢測

分別取A、B、C各組樣品，用掃描電鏡(JSM-6460，Hitachi，日本)觀察其表面形貌；并用X射線能譜儀(JSM- 6460，Hitachi，日本)分析樣品表面的化學組成。

1.3 樣品表面接觸角測量

接觸角測量采用液滴法，于室溫下在接觸角測量系統及其配套軟件(Easy-Drop Standard，Kruss，德國)上完成。具體方法如下：取A、B、C各組樣品，分別在其表面滴8 μL去離子水，然后采用數字成像技術采集液滴影像，并通過系統附帶的DSAl軟件分析液滴形狀而測得接觸角；記錄結果為液滴左右雙側接觸角的平均值，每個試樣各測量5次。

1.4 BMMSCs原代培養

取人的髂骨骨松質(知情同意)，PBS沖洗3～5次，將血細胞沖掉，剪刀剪碎，細胞培養液為DMEM, 含100 mL/L新生牛血清(Gibco, 美國)和10 g/L青/鏈霉素。置于37 ℃、50 mL/L CO2濕潤條件下培養，培養至2～5代用于實驗。

1.5 細胞形態觀察

將各組樣品置于24孔板中，接種密度為2×104/孔，細胞培養4 d后PBS和雙蒸水輕柔漂洗，然后加入30 mL/L戊二醛、4 ℃過夜，乙醇梯度脫水、干燥和噴金后, SEM觀察細胞形態。

1.6 細胞黏附實驗

將鈷60消毒后的樣品置于24孔板內，細胞接種前24孔板紫外線照射30 min。細胞接種密度為2×104/孔，分別于培養30、60、120 min后，將鈦片轉移至新24孔板，PBS漂洗3次以去掉未黏附的細胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min。PBS再次漂洗3次后，每孔加入200 μL DAPI工作液，37 ℃避光孵育15 min；PBS漂洗3次，4 ℃避光保存，激光共聚焦顯微鏡(FV1000, Olympus, 日本)下隨機選擇4個視野觀察并拍照。

1.7 細胞活性檢測

將0.306 g β-甘油磷酸鈉溶于10 mL培養液，加20 μL地塞米松和0.167 mL維生素C配制成100 mL成骨誘導液。將各組樣品置于24孔板中，接種密度為 2×104/孔，第2天換成骨誘導液后，分別培養1、4、7 d，用MTT法檢測細胞活性。到預定時間點后，PBS漂洗3次并轉移至新的24孔板內，每孔加入200 μL的MTT(5 mg/mL)和800 μL無血清無酚紅的DMEM。37 ℃孵育4 h后棄上清，加入1 mL DMSO，每孔分3份轉移至96孔板(每孔200 μL)，分光光度計檢測各孔490 nm處的吸光度值(OD值)。

1.8 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測

將各組樣品置于24孔板中，接種密度為2×104/孔，細胞分別培養7、14 d后，用ALP試劑盒檢測各孔細胞的ALP活性，分光光度計檢測各孔405 nm處的OD值。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 不同處理后鈦片樣品的表面形貌

SEM低倍鏡下可見，A組拋光鈦片表面出現沿拋光方向平行排列的溝槽；B組酸蝕后表面形成縱橫不一的溝壑，同一個晶格內溝壑方向一致，溝壑寬度約0.5 μm；C組酸蝕后表面形成寬度為1.5～2 μm 的溝壑，晶格界限清晰，同一個晶格內溝壑方向一致。高倍鏡下可見，A組表面細微的平行排列的溝槽；B組表面形態均一，在微米結構的基礎上出現直徑為20～40 nm的點狀顆粒，鄰接緊密，頂部較尖銳；C組表面形態均一，為較疏松的山峰狀結節，直徑為70～100 nm，邊緣較圓鈍(圖1)。

圖1 SEM觀察不同處理組鈦片表面(a～c為×5 000; d～f為×50 000)

2.2 不同處理組樣品表面的化學成分

X射線能譜儀分析結果顯示，A組表面主要含Ti元素，以及少量的O、C、Si。B組表面除了O、C、Si、Ti外，還有少量的F，其中F占1.79%，Ti占79.15%。C組與B組類似，其中F占1.81%，Ti占78.47%(表1)。

周家喜讓執法船趕緊向漁船靠攏，逼停漁船，登船檢查。他發現船上江豚保護區禁止使用的非法捕撈工具，便要依法收繳。船上三人急了，想動手搶奪漁網，拉扯中險些跟周家喜發生沖突。

2.3 樣品表面接觸角測量

A組接觸角最大，B、C組明顯小于A組，其中C組最小，B組居中。A組表面接觸角為 40.5±0.65，B組為13.7±1.59，C組為11.8±1.07。

2.4 樣品表面BMMSCs的形態學觀察

SEM觀察結果顯示，與酸蝕組相比，A組表面細胞伸展更好(圖2a)；B、C組表面細胞伸出大量偽足，細胞呈現多邊形；與B組(圖2b)相比，C組(圖2c)表面更多的細胞呈現大量偽足的形態，且細胞之間偽足連接較多。

表1 不同處理組表面化學成分 (%)

圖2 SEM觀察不同處理組鈦表面BMMSCs黏附情況(×1 000)

2.5 細胞黏附實驗

2.6 細胞活性檢測

MTT檢測結果顯示：3種鈦片表面的BMMSCs均呈增長趨勢，1、4 d時3組兩兩相比無統計學差異(P>0.05)；7 d時，B、C組顯著高于A組，且C組高于B組(P<0.05)(圖5)。

圖3 不同處理組鈦片表面BMMSCs的早期黏附(共原焦顯微鏡, ×10)

同一時間點組間兩兩相比P<0.05

7 d時組間兩兩相比P<0.05

2.7 ALP活性

培養7 d時，3組樣品表面BMMSCs的ALP活性檢測結果無統計學差異(P>0.05)；14 d時，B、C組表面BMMSCs的ALP活性均顯著高于A組，且C組高于B組(P<0.05)(圖6)。

14 d時組間兩兩組相比P<0.05

3 討論

目前，用于種植體表面處理的方法多種多樣，其中酸蝕作為臨床種植體表面處理最簡單有效的方法之一，不僅可達到微/納米的仿生結構，而且表面更為清潔，操作簡單，成本低，適用于批量生產。目前常用的酸有HCl、HNO3、HF等，其中HF在酸蝕的過程中可以載入氟元素，研究表明氟化物具有促進成骨基因表達及骨礦化的作用[1]，因此能進一步提高種植體的骨結合率。但目前對于HF酸蝕的具體參數以及控制條件尚無統一的標準。

骨組織的微觀結構由微米級和納米級的結構組成[2]，因此從仿生學的角度來講，在種植體表面構建微/納米梯度有序的表面，能更接近骨的仿生結構特點，提高種植體的骨結合率。本結果發現，經12.5 g/L HF酸蝕后的純鈦表面，在形成微米級結構的基礎上還有納米級結構的存在。這種微、納米分層的結構使種植體表面更接近骨組織的特點。HF酸蝕除了影響種植體表面形貌以外，還對種植體表面原有的化學成分產生了一定的影響，經過HF酸蝕后，純鈦表面載入了氟元素。氟進入骨組織后能直接刺激成骨細胞增生，促進新骨形成，以充填破骨細胞吸收形成的陷窩，使骨小梁增厚，骨量增加。本結果顯示，HF酸蝕后的鈦片表面均載入一定的氟元素，隨著HF酸蝕時間的增加，氟的含量由1.79%增加到1.81%，但氟元素的量與HF酸蝕的時間以及表面形貌無明顯規律，可能由于表面粗糙度的差異，或與氟化物在純鈦表面沉積和結合的方式有關。

種植體的表面形貌對骨結合起重要作用，它不僅直接影響所吸附生物分子的種類、形態和構象，而且影響組織細胞的黏附、增殖、分化和基質的合成、鈣化等一系列生理過程。本結果顯示：HF酸蝕后的表面形成微/納米結構，B組表面溝壑寬度約為0.5 μm，顆粒直徑為20～40 nm，C組表面溝壑寬度為1.5～2.0 μm，顆粒直徑為70～100 nm。有研究發現，當粗糙度值在0.5～2.0 μm時，不僅能夠增加種植體-骨接觸面積，而且能有效增加早期的種植體-骨界面的生物機械嵌合。體外實驗提示，在1.50～3.62 μm 的種植體表面更利于成骨細胞附著生長，微米級涂層可增加種植體與周圍骨組織的機械性結合并具有一定的生物學活性[2]。另外，當上皮基底膜的毛孔為70～100 nm，骨表面粗糙度約為32 nm時，可促進成骨基因如Runx2、ALP、骨涎蛋白在納米級表面表達水平升高，同時IGF-2、BMP2、BMP6也有更強的表達[1]，證實了納米級涂層表面可明顯增加新骨的形成以及種植體的骨結合率[3]。本結果顯示，拋光組更加有利于細胞的伸展，可能是顆粒的高密度會促進細胞的伸展。細胞最初的偽足在100 nm左右，可能是C組偽足較多的一個原因。因此，種植體表面的納米改性可更好的模擬細胞環境，促進細胞的黏附生長，微米結構可提供細胞、能量和營養物質的傳輸通道，微/納米級結構對于提高骨整合均有其獨特的優勢，二者協同有助于更好地促進新骨形成[4]。

氟可以TiFx的形式存在，也可以更復雜的TiOxFy或TiFxOH形成存在[5]。氟離子滲透到鈦表面形貌后，氟化物可作為儲備發揮潛在的成骨作用，刺激成骨細胞的基因表達[6]，提高骨整合。有學者認為，HF酸蝕后種植體表面的羥基化合物、氟化物、氫化物和氧化物的含量和存在形式，以及由其產生的微/納米形貌綜合影響生物細胞的生長和骨再生[7], HF處理后的種植體可促進種植體表面骨的快速生成。這其中氟元素是否起到了促進成骨的作用還需進一步研究。

細胞黏附作為良好骨整合的前提條件至關重要。材料表面良好的潤濕性可以增加與細胞的接觸機會[8]。當種植體植入體內后，首先與體液和組織細胞相接觸。有學者發現，影響細胞黏附的蛋白在不同的潤濕性表面有不同的量和結構[9]。另有研究發現，疏水性的材料表面和蛋白質表面促進蛋白吸附，這可能是親水性表面互相吸附時需要置換掉表面吸附的水分子，比疏水性表面多了能量障礙[10]。本結果顯示，酸蝕組有更好的親水性且更加有利于細胞的黏附、增殖和ALP活性，細胞黏附作為細胞與種植材料相互作用的第一步，會影響細胞后期的增殖、分化和骨基質形成，C組表面細胞的增殖和ALP活性均高于B組，這可能與最初的細胞黏附有關，也可能間接受表面吸附蛋白的影響。

純鈦經12.5 g/L HF酸蝕后在載入氟元素的同時形成了微/納米級的表面形貌，隨著酸蝕時間的變化，會影響表面微/納米形貌的尺寸，從而進一步影響表面黏附細胞的生物學活性。對于體內成骨的效果，以及能否通過改變HF酸蝕參數，進而找到一個最佳濃度和時間的范圍，以實現更加有效的成骨作用，有待于進一步研究及探索。

[1]Monjo M, Lamolle SF, Lyngstadaas SP,etal. In vivo expression of osteogenic markers and bone mineral density at the surface offluoride-modified titanium implants [J].Biomaterials, 2008, 29(28): 3771-3780.[2]Kong DS. The influence of fluoride on the physicochemical properties of anodic oxide films formed on titanium surfaces [J].Langmuir, 2008, 24(10): 5324-5331.

[3]Dohan Ehrenfest DM, Coelho PG, Kang BS,etal. Classification of osseointegrated implant surfaces: material, chemistry and topography [J].TrendsBiotechnol, 2010, 28(4): 198-206.

[4]Shalabi MM, Gortemaker A, Van't Hof MA. Implant surface roughness and bone healing: a systematic review [J].JDentRes, 2006, 85(6): 496-500.

[5]Guo J, Padilla RJ, Ambrose W. The effect of hydrofluoric acid treatment of TiO2grit blasted titanium implants on adherent osteoblast gene expression in vitro and in vivo [J].Biomaterials, 2007, 28(36): 5418-5425.

[6]Ellingsen JE, Johansson CB, Wennerberg A. Improved retention and bone-to implant contact with fluoride-modified titanium implants [J].IntJOralMaxilloacImplants, 2004, 19(5): 659-666.

[7]于衛強.種植體表面納米改性的研究進展[J]. 國際口腔醫學雜志, 2008, 35(6): 665-668.

[8]Jimbo R, Coelho PG, Bryington M,etal. Nano hydroxyapatite-caoted implants improve bone nanomechanial properties [J].JDentRes, 2012, 91(12): 1172-1177.

[9]Klein MO, Bijelic A, Ziebart T,etal. Submicron scale-structured hydrophilic titanium surfaces promote earlyosteogenic gene response for cell adhesion and cell differentiation [J].ClinImplantDentRelatRes, 2013, 15(2): 166-175.

[10]Lamolle SF, Monjo M, Rubert M,etal. The effect of hydrofluoric acid treatment of titanium surface on nanostructural and chemical changes and the growth of MC3T3-E1 cells [J].Biomaterials, 2009, 30(5): 736-742.

Effects of hydrofluoric acid-treated titanium micro/nano surface on the biological activity of bone marrow mesenchymal stem cells

SHEN Ming- ming*, LI Yan- rong, QI Ya- ping, FU Qian, QIN Dong- ze, LIANG Jian- fei, ZHAO Yun- zhuan

(*DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolofStomatology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

AIM: To evaluate the effects of hydrofluoric (HF) acid- treated titanium surfaces on the biological activity of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs). METHODS: Titanium plates were divided into 3 groups, the suface of the samples was polished in group A, etched by 12.5 g/L HF acid for 1 min group B and etched by 12.5 g/L HF acid for 15 min Group C. The surface of the sample was observed by scanning electron microscopy (SEM). The suxface chemical composition was assessed by energy dispersive X- Ray spectroscopy detector (EDS). Contact angles were detected by drop method . BMMSCs adhesion and morphology were examined by confocal microscopy and SEM. Cell viability and ALP activity were assessed by MTT assay and ALP detection kit. RESULTS: Micro/nano-scale surface structures were formed after HF etching. The sample surfaces of group B and C were loaded with fluorine. Contact angle of etching groups was significantly smaller than that of polishing group. HF- treated titanium surfaces significantly promoted adhesion, proliferation and ALP activity of BMMSCs. Furthermore, the effects of group C was greater than those of group B. CONCLUSION: HF acid-etch may forme different size of micro/nano- scale structures and load with fluorineon on titanium surface; can improve the biological activity of BMMSCs.

HF; acid etching; micro/nano; surface modification; biological activity

2014-09-16;

2015-06-09

國家自然科學基金(81371186)

申明明(1986-)，女，漢族，河北人。碩士生(導師：趙云轉)

趙云轉，E-mail：zhyzh2962@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0472-06