抗牙齦卟啉單胞菌卵黃抗體的制備、純化和生物學特性鑒定

董 瑤, 徐 燕, 馬 倩, 孟明理, 沈繼龍, 徐振山, 宋禮華

(安徽 合肥 230032：1．安徽醫科大學口腔醫學院 安徽醫科大學附屬口腔醫院牙周黏膜科 安徽省口腔疾病研究中心實驗室；2.安徽安科生物工程(集團)股份有限公司；3.安徽醫科大學人獸共患病安徽省重點實驗室)

抗牙齦卟啉單胞菌卵黃抗體的制備、純化和生物學特性鑒定

董 瑤1, 徐 燕1, 馬 倩2, 孟明理1, 沈繼龍3, 徐振山2, 宋禮華2

(安徽 合肥 230032：1．安徽醫科大學口腔醫學院 安徽醫科大學附屬口腔醫院牙周黏膜科 安徽省口腔疾病研究中心實驗室；2.安徽安科生物工程(集團)股份有限公司；3.安徽醫科大學人獸共患病安徽省重點實驗室)

目的: 制備特異性抗牙齦卟啉單胞菌(Pg)的雞卵黃免疫球蛋白(IgY)并檢測其生物學特性。方法：厭氧培養牙齦卟啉單胞菌，將甲醛滅活的菌體經翅膀下淺層肌肉免疫150日齡羅曼母雞3次，每次間隔10 d。取雞蛋用兩步硫酸銨沉淀法提取IgY，BCA法測定蛋白質含量，ELLSA法檢測純化后IgY的特異性和抗體效價變化，并進行SDS- PAGE和Western blotting分析。觀察抗Pg- IgY對紅細胞凝集的抑制作用。結果：經3次免疫后，抗體滴度最高可達25 600，純化后每個雞蛋可得約70 mg IgY抗體; SDS- PAGE分析，純化的IgY有1條主要蛋白帶，相對分子質量(Mr)為180 kD，純度為65%; Western blotting分析, 該IgY抗體可識別抗原Pg。每孔3.125 μgPg- IgY可有效抑制Pg的紅細胞凝集活性；1 mg/mLPg- IgY可有效抑制Pg生長。結論： 本研究得到的IgY特異性強，產量和純度高。

牙齦卟啉單胞菌; 免疫球蛋白Y; 卵黃抗體

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):459]

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivals,Pg)是目前公認慢性牙周炎的主要致病菌，與牙周炎的發生發展密切相關[1]，85%的病變位點可檢測到Pg的存在，而在健康的牙齦中幾乎沒有或者數量很少[2]。Pg擁有一系列的致病因子，如各種酶、內毒素、囊泡和纖毛等[3]。針對Pg的免疫治療有可能對牙周炎的預防和治療產生積極的影響。有研究發現，慢性牙周炎患者的血清和齦溝液中有Pg特異性抗體的存在[4]，然而抗體的產生只是表明Pg激活了宿主的免疫防御反應，但這些抗體并不足以清除Pg引起的感染[5]。在一項以食蟹獼猴為對象的動物實驗中，通過肌肉或者皮下注射甲醛滅活的Pg可成功誘導出特異性血清抗體產生[6]，而且還能抑制動物絲線結扎法構建的實驗型牙周炎過程中Pg的定植，但這些抗體并未起到完整的保護作用[7]。如何獲得大量安全有效的抗體以用于牙周病的免疫治療卵黃抗體以其安全、穩定的理化性質，容易獲取等優越性引起了我們的關注。本實驗用甲醛滅活的Pg免疫產蛋母雞，以獲得特異性抗Pg的卵黃抗體，并評價其免疫效果和抗體功能，進一步探索卵黃抗體的大規模制備工藝，以期為卵黃抗體在牙周病免疫治療中的應用和推廣提供思路和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設備

羅曼母雞[8]60只(安徽醫科大學動物實驗中心提供，隔離飼養至150日齡供免疫用)；完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant, CFA)、不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)(Sigma，美國)；辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgY(SC-2428, santa cruz，美國)；牙齦卟啉單胞菌(JCM12257)(國際標準菌株ATCC33277，日本微生物菌種保藏中心)；牛-腦心浸液培養基(brain heart infusion，BHI)CM917(北京陸橋技術)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物)；BCA檢測試劑盒(北京原平皓生物); 考馬斯亮藍R-250、硝酸纖維素膜(NC膜，0.22 μm)(北京索萊寶生物科技)；預染蛋白Marker(Thermo Scientific, 美國)；酶標儀(ELX808U，Bio- Tek，美國)；正倒置顯微鏡(Nikon，日本)；厭氧培養箱(Don Whitley DG250 Anaerobic workstation，英國)；凝膠圖像處理系統1600(GIS)(上海天能)。

1.2 抗原制備——牙齦卟啉單胞菌的厭氧培養

1.2.1 BHI羊血培養基制備

BHI液體培養基含BHI基礎粉37 g，維生素K1 1 mg，氯化血紅素5 mg，半胱氨酸0.5 g。BHI羊血固體培養基制備方法：在上述液體培養基配方基礎上加入15 g/L瓊脂和0.8 g/L凍干脫纖維凍融羊血(北京友康基業生物科技)混勻，平鋪于無菌培養皿中；冷卻至室溫后4 ℃保存備用。

1.2.2Pg凍干粉復蘇和培養

按照JCM說明進行操作。畫線法接種于BHI羊血固體培養基，置于厭氧箱(混合氣比例為100 mL/L CO2、100 mL/L H2、800 mL/L N2)中 37 ℃培養24～48 h，觀察有無特征性黑色菌落生成，并進行革蘭氏染色鑒定。將固體培養基上的單克隆菌落接種于BHI液體培養基上用以增菌，厭氧培養48 h, 離心(4 000 r/min, 10 min)開收集菌體。

1.2.3Pg滅活和抗原乳化

10 g/L甲醛滅活Pg菌體，4 ℃過夜，無菌PBS清洗3次，調制菌液濃度為1.0×109CFU /mL，取兩個5 mL注射器并去掉針頭，通過無菌塑料軟管聯通組裝成抗原乳化裝備，一注射器內為1 mL 滅活的P.gingivals菌液，另一注射器內為等量的弗氏佐劑，通過推拉注射器將兩側液體混合(注意保持直線，防止堵塞)，推拉時要保證速度又快又穩，連續推拉30 min，最終呈乳白色的油包水狀注射劑，用于以下實驗。

1.3 蛋雞免疫

60只羅曼母雞隨機分為兩組：空白對照組(20只)不免疫，實驗組(40只)免疫Pg。經雞翅膀下淺層肌肉多點注射上述已滅活的Pg菌液免疫母雞，共免疫3次，每只雞每次注射1 mL，首次免疫用CFA，后2次用IFA加強免疫，每次免疫間隔時間為10 d。初次免疫后即開始收集雞蛋，標記后4 ℃保存。免疫前的雞蛋同樣保存作為空白對照。

1.4 IgY提取和純化

1.4.1 改良水稀釋法獲得水溶性卵黃抗體溶液

清潔雞蛋表面，卵黃分離器去除蛋白和卵黃膜，卵黃液與蒸餾水(1 ∶8)在4 ℃條件下稀釋，攪拌均勻后逐滴加入0.1 mol/L HCl酸化，使卵黃最終稀釋為1 ∶9; 調節pH值為5.0～5.2，4 ℃孵化12 h，離心(10 000 r/min, 20 min, 4 ℃)并收集上清，所收集上清液即水溶性IgY溶液(water - soluble-fraction, WSF)，-20 ℃保存備用。

1.4.2 硫酸銨沉淀法純化IgY

向上述WSF中滴加飽和硫酸銨使硫酸銨最終濃度為400 g/L，充分攪拌均勻，同上法離心得沉淀，該沉淀再次用去離子水溶解, 即得一步硫銨法IgY; 再次重復上述硫酸銨沉淀法即得兩步硫銨法IgY。溶液置于常規處理過的透析袋中，以蒸餾水透析24 h(4 ℃)，換水3次，以去除硫酸銨， 分裝后-20 ℃保存。

1.5 IgY檢測實驗

1.5.1 蛋白含量的測定

用BCA法測定蛋白含量，將濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的標準品20 μL。分別加到96孔酶標板的標準品孔中，再取20 μL純化IgY加到樣品孔中。取5 mL BCA試劑(A液)和100 μL Ca2+試劑(B液)以50 ∶1的濃度配制成BCA工作液，每孔加入200 μL的BCA工作液，37 ℃ 反應30 min，在酶標儀上讀取吸光度(A562)值，繪制標準曲線，計算樣品的蛋白含量。

1.5.2 IgY分子鑒定

1.5.2.1 SDS- PAGE電泳

非還原型SDS- PAGE檢測相對分子質量(Mr)，其濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為7.5%。還原型SDS- PAGE電泳觀察IgY重鏈(Heavy chain)和輕鏈(Light chain)，其濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%，每孔的上樣量為10 μg。

1.5.2.2 Western Bloting檢測抗體特異性

將超聲破碎的Pg溶液進行還原型SDS- PAGE電泳后，轉移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)上，用50 g/L的脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，含0.05%(體積分數)Tween20的TBS(pH=7.4)液清洗3次×5 min，孵一抗(實驗組一抗為免疫后的抗Pg- IgY，免疫前雞蛋的IgY作為陰性對照，濃度均為20 μg/mL)4 ℃過夜；同上洗膜后孵育二抗，羊抗雞HRP- IgY(1 ∶8 000)，DAB顯色。

1.5.2.3 ELLSA檢測IgY抗體滴度變化

用ELLSA方法檢測不同免疫時間點卵黃抗體滴度的變化，并繪制滴度變化趨勢圖。96孔板包被超聲破碎的Pg溶液，濃度調制為10 μg/mL，37 ℃保溫箱中孵育2 h后，再加入10 g/L牛血清白蛋白(BSA)的非特異性抗原，37 ℃封閉2 h，用含0.05%(體積分數)Tween20的PBS液清洗 3次，拍干。逐孔加2倍稀釋的IgY(從原液開始，1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8……1 ∶215共16個濃度組)100 μL，37 ℃溫育2 h。洗滌后加入羊抗雞HRP- IgY(產品原液稀釋10 000)100 μL，37 ℃溫育1 h；鄰苯二胺(OPD)37 ℃顯色15 min，50 μL 硫酸(2 mol/L)終止反應，在酶標儀上讀取OD450值。以10 g/L BSA作陰性對照，PBS作空白對照。結果判斷：測定孔值(S)/陰性對照孔OD450值(N)，結果大于2.1為陽性, 該孔對應樣品的稀釋倍數為IgY抗體的滴度。

1.5.2.4 評價IgY對Pg生長的抑制作用

取15 mL試管8個，隨機分為4組(n=2)。Pg- IgY(從第3次免疫后10～30 d的雞蛋提取)用BHI液體培養基分別重懸為4、2、1 mg/mL，未免疫雞蛋的IgY(4 mg/mL)同樣用BHI液體培養基重懸作為對照組。過濾除菌后，每管9 mL溶液，再向每個試管加入1 mL濃度為1×108CFU/mL的Pg菌液，厭氧培養箱內培養，每小時取樣100 μL，每管取2個樣本，4 ℃保存，連續取樣24 h后，檢測所有樣本的OD600 nm并繪制細菌生長曲線。

1.5.2.5 抗Pg- IgY抑制紅細胞凝集實驗

血球凝集(HA)試驗，取新鮮培養的Pg菌液率離心(10 000 r/min, 離心10 min)，PBS重懸，調整菌液濃度至1×109CFU/mL，記為n。在96孔“U”形微量反應板上第一孔加50 μL濃度為n的Pg菌懸液，依次用生理鹽水倍比稀釋至第8孔；第9孔為紅細胞對照，所有孔均加入0.5%人紅細胞懸液50 μL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結果。

血球凝集抑制(HI)試驗，根據HA試驗結果，確定Pg菌的血凝價，配制出4倍血凝單位菌懸液(1×108)。第1孔加待檢測抗IgY 50 μL(1 μg/μL)，倍比稀釋至第7孔；第8孔加入Pg對照。所有孔均加入50 μL 4個血凝單位的Pg菌液和50 μL 0.5%人紅細胞懸液，振蕩混合均勻，室溫下靜置后觀察結果。

1.6 統計學分析

采用SPASS 13.0軟件對所得數據(means±SD)進行one- way ANOVA統計分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1Pg鑒定

Pg在BHI羊血瓊脂板上形成特征性菌落，黑色，圓形，表面光滑。顯微鏡油鏡下觀察，革蘭氏染色結果顯示Pg為G-菌，紅色，形態為球桿菌或短桿菌(圖1)。

圖1 Pg革蘭氏染色結果(油鏡，×1 000)

2.2 IgY蛋白含量的測定

BCA檢測結果顯示，每個雞蛋的WSF溶液含有150 mg蛋白，經鹽析、透析純化后每個雞蛋大約得到70 mg的總IgY。

2.3 電泳結果

非還原型SDS- PAGE結果顯示，硫酸銨沉淀法純化后的IgY與Thermo IgY提純試劑盒提取的IgY有一致的主帶，其分子量約為180 kD(圖2)，符合理論值。還原型SDS- PAGE結果顯示，β-巰基乙醇還原裂解后的IgY雜帶較多，其中含有65 kD的重鏈和25 kD 輕鏈2條主帶，與理論值一致(圖3); 經GIS軟件分析重鏈純度，一步硫銨法純化的IgY純度為50%，兩步硫銨法純化的IgY純度為65%。

2.4 Western Bloting檢測Pg- IgY抗體特異性

Western Bloting檢測結果發現，抗Pg- IgY能識別Pg的諸多片段，用GIS凝膠軟件分析圖像，發現抗Pg- IgY 能識別分子量為84、73、58、50、45、39、37、34 kD的條帶(圖4)，此蛋白可能是Pg的分解片段。

2.5 ELLSA測定IgY抗體滴度

蛋雞經3次免疫后特異性抗體滴度高達25 600，并保持高滴度30 d，隨后滴度迅速下降，待距第3次免疫70 d時抗體滴度下降到3 200，而空白對照組特異性抗體滴度始終接近0(圖5)。以上結果顯示，所得抗Pg- IgY能特異性結合Pg，說明本實驗中使用的免疫程序和硫酸銨沉淀法純化IgY都是可取的。

M.蛋白標記物;1.未純化的水溶性IgY溶液;2.兩步硫銨法純化的IgY;3.ThermoIgY提純試劑盒純化的IgYM.蛋白標記物;1.未純化的水溶性IgY溶液;2.一步硫銨法純化的IgY;3.兩步硫銨法純化的IgYM.預染型marker;1.陰性對照組;2.Pg-IgY組

圖2 IgY的非還原型SDS-PAGE分析圖3 IgY的還原型SDS-PAGE分析圖4 WesternBloting檢測Pg-IgY抗體特異性

圖5 抗Pg- IgY滴度變化曲線

2.6 抗Pg- IgY 抑制紅細胞凝集實驗

血球凝集(HA)試驗結果顯示，最低濃度為3×107CFU/mL 的Pg可引起紅細胞凝集(箭頭示)(圖6a)。血球凝集抑制(HI)試驗結果顯示，每孔3.125 μgPg- IgY可有效抑制Pg的紅細胞凝集活性(箭頭示)，而非特異性的IgY無該功能(圖6b)。紅細胞凝集實驗結果判定：紅細胞沉于孔底呈點狀為不凝集; 平鋪呈網狀為凝集。

圖6 抗Pg- IgY抑制紅細胞凝集實驗(n為1×109 CFU/mL)

2.7 評價IgY對Pg生長的抑制作用

如圖7所示，未免疫雞的IgY組和1 mg/mLPg- IgY組的Pg在8 h后開始進入對數生長期，2、4 mg/mLPg- IgY組的Pg在10 h時開始進入對數生長期。結果顯示，Pg- IgY可延遲Pg進入對數生長期的時間點，并能夠抑制Pg生長，且具有濃度依賴性。統計學分析發現，1～5 h的每個時間點，4組間吸光度值兩兩相比均無統計學差異(P>0.05)；6～7 h時，未免疫雞的IgY組與其他3個實驗組相比均有統計學差異(P<0.05)，而3個實驗組組間相比無統計學差異(P>0.05)；8～24 h 時，4組間兩兩相比均有統計學差異(P<0.05)。

圖7 抗Pg- IgY對Pg生長作用影響

3 討論

卵黃抗體(immunoglobulin Y，IgY)是禽類主要的血清免疫球蛋白，可經過血液由母體的特異性聚集于卵黃之中。Kovacs等研究發現在相同時間里，1只雞所能提供IgY的量是1只兔子提供血清IgG的18倍，而且IgY的生產過程不需要采血，只需收集雞蛋即可，不會對實驗動物產生傷害[9]。Tini M等報道：每個卵黃含有50～100 mg IgY，其中2%～10%為特異性抗體，每只雞1年大約可提供280只雞蛋，因此使用少量的抗原免疫母雞就可獲得大量質量均一的特異性IgY[10]。

IgY是一種7S免疫球蛋白，與哺乳動物IgG略有不同。該蛋白質分子量約為180 kD，含兩個亞單位即65～70 kD的重鏈和22～30 kD的輕鏈。與哺乳類IgG相比，IgY的鉸鏈區短、可變性差且Fc段長[11]。IgY具有以下特點：IgY不激活補體、不結合類風濕因子、不與哺乳動物Fc受體和補體結合、與哺乳動物免疫球蛋白之間不發生交叉血清學反應；理化穩定性好, 能耐酸, 耐熱, 在溫度低于75 ℃、pH>3的酸性環境中仍能很好地保持其生物學活性[12]。

近年來，IgY在疾病被動免疫治療中得到廣泛應用。C. Vega等[13]給感染了輪狀病毒的小牛喂食抗輪狀病毒的卵黃抗體，發現該卵黃抗體可治療由輪狀病毒引起的小牛腹瀉。Smith DJ等用變異鏈球菌葡聚糖結合蛋白B (glucan- binding protein B,GBP- B)免疫雞獲得特異性抗GBP- B的IgY，發現該IgY可預防由變異鏈球菌引起的齲損[14], 含有抗變異鏈球菌葡糖基轉移酶IgY的糖果能夠抑制變異鏈球菌在健康青少年口內定植[15]。

卵黃抗體的提取方法有水稀釋法、聚乙二醇沉淀法、硫酸葡聚糖沉淀法等。水稀釋法獲得抗體的產量和純度最高，且應用的方便性和大規模生產的可能性也優于其他方法。本研究選用了改良水稀釋法結合硫酸銨沉淀成功提取出抗Pg- IgY，平均每個雞蛋可得到卵黃抗體70 mg，操作簡便快捷，且抗體純度較高。雞卵黃中卵黃抗體的含量和雞的品種、周齡及抗原的種類等因素有關。本研究采用羅曼母雞，提取步驟是先得到卵黃抗體的水溶性成分，通過離心分離去除脂肪，再用硫酸銨沉淀兩次得到卵黃抗體溶液，第1步硫酸銨沉淀后，純度大約為50%，雜質主要是分子量為35 kD的載脂蛋白[16]、40 kD的卵黃高磷蛋白[17]。經過第2步硫酸銨沉淀雜帶明顯減少，純度達到65%。

Pg是一種G-專性厭氧菌，是目前口腔內蛋白水解活性最強的細菌，因為它能產生半胱氨酸蛋白酶、膠原酶[18]。Hamajima S等用重組Pg外膜 40 kD蛋白免疫蛋雞獲得針對該蛋白的卵黃抗體，發現該卵黃抗體可有效抑制牙齦卟啉單胞菌與戈登鏈球菌的聚集[19]。Yokoyama K等使用牙齦素免疫白萊航雞，獲得抗牙齦素IgY，并且制成IgY濃度為20%的軟膏，用于清潔刮治和根面平整后的牙周炎患者，結果發現，與未使用者相比，使用IgY軟膏的患者Pg的數量少，臨床癥狀輕[20]。這是利用牙周微生物進行被動免疫方面的重大嘗試和進步。

由于Pg不能酵解糖，只能通過從局部環境中的氨基酸和多肽獲取生長所需的營養物質，因此細菌在口腔上皮細胞和組織的黏附能力對于其生存至關重要，而Pg的紅細胞凝集活性被認為與細菌黏附宿主細胞的能力相關，后者是細菌感染的第一步。鐵/亞鐵血紅素是Pg生存和毒力發揮所必需的營養成分[21]，其來源主要為血紅蛋白，因此Pg的紅細胞凝集活性對其營養獲取和生存亦至關重要[22]。單克隆抗體61BG1.3和mAb-Pg- vc可以抑制Pg的紅細胞凝集活性，抗體識別和結合位點是由rgpA、kgp、hagA這3個基因編碼的黏附片段Hgp44[23]。Simpson W等通過敲除A7436的kgp，成功構建了缺失kgp的Pg突變菌株，該突變菌株結合氯化血紅素和血紅蛋白的能力顯著低于PgA7436，該突變菌株在含有血紅蛋白的培養基中生長遲緩[24]。有研究發現，當rgpA rgpB基因突變體和rgpA kgp 基因突變體紅細胞凝集活性降低時[25]，發現rgpA 、kgp 、hagA 基因突變體則無紅細胞凝集活性[26]，表明這3個基因與Pg的紅細胞凝集活性有關。本實驗結果顯示，特異性抗Pg- IgY能夠抑制Pg的紅細胞凝集活性，推測Pg- IgY能抑制Pg在牙周袋內的定植和增殖。有研究發現，抗Pg- IgY能識別Pg的諸多片段(84、73、58、50、45、39、37、34 kD), 而這些蛋白可能是Pg的分解片段[27]。Inoshita等已經從rgpA、kgp的黏附素區域純化得到分子量分別為24、37、44 kD的片段[28]。卵黃抗體識別的50 kD條帶被認為是rgpB分子[29]。

本研究成功制備了高效價特異性卵黃抗體，并通過兩步硫銨沉淀純化得到純度較高的卵黃抗體，該抗體能識別牙齦卟啉單胞菌的諸多片段，抑制Pg生長，并且具有較好的中和Pg紅細胞凝集活性。這為IgY的大規模制備提供了新的參考，也為IgY抗體應用于牙周病被動免疫治療提供了實驗依據。

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Preparation, purification and characterization of egg yolk immunoglobulin Y specific toporphyromonasgingivalis

DONG Yao*, XU Yan, MA Qian, MENG Ming- li, SHEN Ji- long, XU Zhen- shan, SONG Li- hua

(*StomatologicHospital﹠College,AnhuiMedicalUniversity,KeyLab.ofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince,Hefei230032,China)

AIM: To prepare egg yolk immunoglobulin (IgY) againstPorphyromonasgingivalisand to study its biological characteristics. METHODS: Ten 150 day-old laying hens were immunized withPorphyromonasgingivalisand IgY was isolated from the egg yolk by the water dilution (WD) method and 2 steps of ammonium sulfate purification. The titers and specificity of the purified antibodies were assessed by ELLSA. The molecular weight were measured by SDS-PAGE. The antigenicity and function of the IgY were demonstrated by western blotting and the hemagglutination inhibition (HI) test respectively. RESULTS: The yield of IgY was 70 mg per yolk with the purity of 65%. Its titer was 25 600.Pg-IgY could bound specifically toPorphyromonasgingivalisand could inhibit the hemagglutination at 3.125 μg/well. CONCLUSION: The production and purity of IgY are high, the IgY has strong specificity against TPorphyromonasgingivalis.

porphyromonasgingivalis; immunoglobulin Y; egg yolk immunogolbuin

2015-01-08;

2015-06-09

安徽省自然科學基金 (1308085MH130，1408085MKL28)

董 瑤(1988-)，女，漢族，安徽宿州人。碩士生(導師：徐燕 )

徐 燕，E-mail：173236344@qq.com

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0459-06

安徽安科生物校企合作項目(K2015011)