突發性聾患者糖皮質激素治療前后外周血單個核細胞Nrf2表達分析*

齊慧　戴艷紅　后婕　周瓊瓊　魏先梅　楊燁　佘萬東

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突發性聾患者糖皮質激素治療前后外周血單個核細胞Nrf2表達分析*

齊慧1戴艷紅1后婕1周瓊瓊1魏先梅1楊燁1佘萬東1

【摘要】目的探討突發性聾(sudden sensorineural hearing loss，SSNHL)患者體內轉錄因子NF-E2相關因子2(nuclear factor erythroid2 related factor,Nrf2)的變化及其與糖皮質激素(glucocorticoid, GC)抵抗的關系。 方法分離30例SSNHL患者治療前后外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，提取總RNA，采用實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR，QRT-PCR)方法檢測其PBMCs中Nrf2 mRNA的表達量。根據就診時間及用藥情況將這30例SSNHL患者分為初發組(7例)和難治組(23例)；難治組又根據聽力恢復是否≥15 dB分為GC有效組(10例)及抵抗組(13例)；選擇10例聽力正常的志愿者為對照組；比較各組SSNHL患者治療前后Nrf2 mRNA表達量及與GC抵抗的關系。結果①30例患者中，治療前難治組、初發組Nrf2 mRNA表達量分別為0.520±0.049、0.514±0.052，兩組間差異無統計學意義(F=0.052,P=0.911)，但均低于對照組(0.607±0.106)(F=6.483,P=0.004)；②治療前難治組中GC有效組、抵抗組患耳0.25~8 kHz平均聽閾(pure tone average, PTA)分別為81.75±13.28和91.80±13.79 dB HL，治療后分別為54.67±15.65和89.87±13.98 dB HL。治療后GC有效組Nrf2 mRNA表達量(0.560±0.051)較治療前(0.510±0.028)有所上調(t=3.007, P=0.015)，而GC抵抗組Nrf2 mRNA表達量(0.519±0.054)較治療前(0.526±0.060)無明顯變化(t=0.485, P=0.636)。結論Nrf2表達上調或下降可能參與SSNHL的發生發展；難治性SSNHL患者GC抵抗的機制可能與Nrf2低表達相關，上調Nrf2可能改善難治性SSNHL患者對GC的敏感性和預后。

【關鍵詞】突發性聾； 糖皮質激素；NF-E2相關因子2；外周血單個核細胞

網絡出版時間：2015-12-3010：55

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151230.1055.002.html

突發性聾 (sudden sensorineural hearing loss，SSNHL)極為常見，但具體發病機制仍然不明，目前認為可能與病毒感染、血管因素、自身免疫和代謝紊亂等相關[1]。糖皮質激素(glucocorticoid, GC)是目前較為公認治療突發性聾有效的藥物[1~4]，但經過積極治療后，仍有部分患者聽力無明顯改善,提示部分患者可能存在GC抵抗[5,6]。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2, HDAC2)作為一種能夠從組蛋白N-乙?；嚢彼嵘先コ阴；拿?，可通過調控組蛋白的乙?；?，影響染色體重塑，被認為是炎癥性疾病GC抵抗的重要因素[7]。本課題組前期研究發現，經過鼓室灌注GC加全身抗氧化劑治療后，約半數突發性聾患者的外周單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中HDAC2 表達增加，聽力改善，而GC治療無效患者HDAC2蛋白活性是下降的，提示HDAC2下調可能是難治性SSNHL患者激素抵抗的重要原因[8,9]，但其下調的原因尚不明確。有研究表明轉錄因子NF-E2相關因子2(nuclear factor erythroid2 related factor,Nrf2)的下調可使HDAC2蛋白活性降低，從而導致患者GC抵抗[10]。Nrf2作為一種抗氧化轉錄因子，在抵制各種壓力環境下導致的氧化應激(oxidative Stress，OS)中發揮關鍵作用[11]。生理條件下，Nrf2在細胞質中與Kelch樣ECH聯合蛋白1(kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)結合，被泛素化。在氧化應激刺激時，Nrf2與Keap1解離而發生活化[12]，活化的Nrf2進入細胞核,與抗氧化反應元件(ARE)結合，啟動ARE下游的基因轉錄和表達，以抵抗內外界的有害刺激[13]。本研究在前期研究[8,9]的基礎上，應用實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR，QRT-PCR)方法檢測SSNHL患者GC治療前后PBMCs中Nrf2 mRNA的表達量，探討其表達變化及其與GC抵抗的關系。

1資料與方法

1.1研究對象及分組研究對象為2014年7月至2015年5月于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院確診并收治的SSNHL患者30例，其中男15例，女15例，年齡24～74歲，平均43.93±15.41歲。納入標準：符合中華醫學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會制定的突發性聾診斷標準[14]，0.5~4 kHz平均聽閾(pure tone average, PTA)>60 dB HL，無感音神經性聾家族史；均為單耳發病，排除了中耳、蝸后病變或有明確病因引起的感音神經性聽力損失；排除中途退出研究或失訪者。

根據有無接受10天以上的常規治療(包括全身使用GC、改善微循環、營養神經等)分為初發組(7例)和難治組(23例)。所有患者發病至接受此次治療的時間間隔為2～57天，其中初發組患者平均為3.85±1.06天，難治組患者平均為23.17±16.43天；難治組又根據發病后三個月時受損頻率(0.25~8 kHz)PTA改善是否≥15 dB分為GC有效組和GC抵抗組[8,9]。選取聽力正常、無耳部疾病的鼻中隔偏曲志愿者10例作為正常對照組，其中男6例，女4例，年齡19～36歲，平均26.20±5.38歲。本研究獲得南京大學醫學院附屬鼓樓醫院醫學倫理委員會批準。

1.2治療方法初發組患者全身靜脈滴注甲強龍(海正輝瑞公司)(80 mg/天×4天，然后40 mg/天×3天，20 mg/天×3天)，難治組患者經鼓膜置管鼓室給予甲強龍(40 mg/ml，海正輝瑞公司)(20 mg/天×10天)[6]。所有患者均同時接受銀杏葉提取物注射液、單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉連續治療10天。10天后復查純音聽閾，每月隨訪觀察鼓膜及聽力改善情況。

1.3QRT-PCR法檢測PBMCs中Nrf2 mRNA表達在取得受試者同意后，分別于治療前、治療后第10天采集患者組及對照組空腹外周血20 ml，放入含有EDTA抗凝的試劑管內，采用密度梯度離心法分離PBMCs；按照Trizol法(Invitrogen公司)提取總RNA，使用前用紫外分光光度計測其濃度和純度。根據TAKARA公司試劑盒Prime Script RT Master Mix說明書操作，以5 μl總RNA為模板，進行逆轉錄，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec,合成cDNA，-20 ℃冰箱保存備用。

QRT-PCR檢測Nrf2 mRNA表達：GAPDH及Nrf2引物由TAKARA公司合成(表1)，按TAKARA SYBR Premix EX TaqII說明書配備模板，上機(ABI StepOnePlusTMReal-Time PCR System)擴增，以GAPDH作為內參，對Nrf2 mRNA表達進行相對定量。反應條件：PCR循環參數設定為95 ℃預變性30秒，95 ℃變性5秒，60 ℃退火/延伸34秒，循環40次，擴增反應結束后，進行融解曲線分析，判定是否有非特異性擴增產物的存在。計算Nrf2及GAPDH基因的Ct值，兩者之差即為△Ct值，再進行2-△Ct計算，即作為評價Nrf2 mRNA相對表達水平的指標。

表1　RT-PCR引物序列

1.4統計學方法使用SPSS18.0統計軟件分析數據, 本組資料符合正態分布，治療前初發組、 難治組與對照組的組間差異采用單向方差分析，治療前初發組與難治組之間采用獨立樣本T檢驗，同一組治療前后結果比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1初發組、難治組SSNHL患者治療效果初發組和難治組治療后0.25～8 kHz平均PTA較治療前均有所提高(表2)，總有效率為50%，其中初發組有效率為71.43%(5/7)，難治組有效率為43.47%(10/23)。

表2初發、難治組SSNHL患者治療前后PTA

組別例數(例)治療前治療后T值P值初發組792.73±18.7666.15±28.563.178<0.001難治組2384.71±16.5072.21±23.154.0710.019合計3088.47±14.9871.66±24.263.798<0.001

2.2治療前SSNHL患者PBMC中Nrf2 mRNA表達量治療前初發組、難治組Nrf2 mRNA表達量(分別為0.514±0.052和0.520±0.049)均低于對照組(0.607±0.106)，差異有統計學意義(F=6.483，P=0.004)；初發組(0.514±0.052)與難治組Nrf2 mRNA表達量差異無統計學意義(T=0.052，P=0.911)。

2.3難治性SSNHL患者中GC有效組、無效組治療前后PTA及Nrf2 mRNA表達量難治組中治療后GC有效10例(有效組)，GC無效13例(無效組)，治療后GC有效組患者PBMC中Nrf2 mRNA表達量有所上調(P<0.05)，而GC無效組患者Nrf2 mRNA表達量治療前后差異無統計學意義(P>0.05)，治療前GC有效組與GC無效組間Nrf2 mRNA表達量差異無統計學意義，治療后兩組間差異也無統計學意義(均為P>0.05)(表3)。

±s)

注：*與同組治療前Nrf2 mRNA比較，P<0.05，**與同組治療前PTA比較，P<0.01

3討論

有報道指出SSNHL患者體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高[15]，而抗氧化治療可有效提高SSNHL患者GC治療的效果[16]，提示氧化應激可能參與了SSNHL的發生發展，而Nrf2作為一種抗氧化轉錄因子，在機體內主要通過抵制氧化應激，抵抗內外界的有害刺激[13]。本研究結果顯示治療前初發組、難治組突聾患者PBMC中Nrf2 mRNA的表達量均低于正常對照組，提示Nrf2可能參與SSNHL的發生發展。正常情況下，Nrf2表達可以抵消機體升高的氧化應激[13，17]，所以當Nrf2下調時，體內氧化-抗氧化平衡被打破，升高的氧化應激使耳蝸內ROS增多，誘發耳蝸毛細胞和螺旋神經節細胞凋亡或死亡,導致耳聾的發生[18~20]。而升高的ROS，使得細胞內低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF1α)升高[21]，HIF1α通過加強信號通路轉導，進而增加炎癥因子的表達，導致疾病的發生發展[17,22]。本研究中，治療前難治組SSNHL患者與初發組患者之間PBMC中Nrf2 mRNA表達量無統計學差異，可能原因是難治性SSNHL患者在第一次接受常規治療后，體內抗氧化能力尚未提高，聽力無明顯改善，故Nrf2 mRNA的表達量與初診患者相比無明顯提高。

前期研究提示HDAC2蛋白活性下調可能是SSNHL患者發生GC抵抗的原因之一[8,9]，但其下調的原因不明。有報道指出氧化應激能明顯降低HDAC酶的活性，打破組蛋白乙?；?去乙?；胶?，阻斷GC的抗炎效應[12]；也有證據顯示Nrf2減少能夠降低HDAC2蛋白的表達和活性[11，23]，從而導致患者GC不敏感；Nrf2可以通過調控HDAC2去亞硝基化，導致炎癥基因轉錄抑制，從而提高GC敏感性[10]。Adenuga等[24]在Nrf2與HDAC2相關性研究中發現，Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)小鼠肺內的HDAC2水平明顯下降，HDAC2基因的轉錄受Nrf2活性的調節，Nrf2缺失可導致HDAC2的水平降低，降低HDAC2去乙?；幕钚?。本研究發現，GC有效組患者治療后Nrf2 mRNA的表達量較治療前有所上調(P<0.05)，而GC無效組治療前后Nrf2 mRNA的表達量無明顯變化，與前期研究中顯示的難治性SSNHL患者HDAC2蛋白活性的變化一致，提示Nrf2可能參與GC抵抗；因而考慮Nrf2 mRNA表達下調可能參與HDAC2蛋白的活性下降，與其他研究報道的Nrf2與HDAC2相關性相符[10,4,24,25]。GC有效組患者聽力均有提高，Nrf2 mRNA表達量也有所上調，提示Nrf2上調可能有助于改善SSNHL患者的預后。在后期實驗中需要增加樣本量，增加觀察指標，以便進一步的深入研究證實。

參考文獻4

1Stachler RJ, Chandrasekhar SS, Archer SM, et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss[J]. Otolaryngol Head Neck Surg,2012,146:S1.

2中國突發性聾多中心臨床研究協作組.中國突發性聾分型治療的多中心研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2013, 48:355.

3Wei BP, Stathopoulos D, O'Leary S. Steroids for idiopathic sudden sensorineural hearing loss[J]. Cochrane Database Syst Rev,2013,7.doi:10.1002/14651858.

4Schreiber BE , Agrup C , Haskard DO, et al. Sudden sensorineural hearing loss[J]. Lancet,2010,375:1203.

5Nakagawa T, Sakamoto T, Hiraumi H, et al. Topical insulin-like growth factor 1 treatment using gelatin hydrogels for glucocorticoidresistant sudden sensorineural hearing loss: a prospective clinical trial[J]. BMC Med,2010,8:76.

6She W, Dai Y, Du X, et al. Hearing evaluation of intratympanic methylprednisolone perfusion for refractory sudden sensorineural hearing loss[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2010,142:266.

7Barnes PJ , Adack IM. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases[J]. Lancet,2009, 373:1905.

8Hou J, She W, Du X, et al. Histone deacetylase 2 in sudden sensorineural hearing loss patients in response to intratympanic methylprednisolone perfusion[J]. Otolaryngol Head Neck Surg,2015,doi:10.177/0194599815606911.

9后婕, 戴艷紅, 謝利生,等.難治性突發性聾患者外周血單個核細胞內HDAC2表達與其預后的相關性分析[J]. 聽力學及言語疾病雜志,2014,22:559.

10Malhotra D, Thimmulappa RK, Mercado N, et al. Denitrosylation of HDAC2 by targeting Nrf2 restores glucocorticosteroid sensitivity in macrophages from COPD patients[J]. J Clin Invest,2011, 121:4289..

11Strom J, Xu B, Tian X, et al. Nrf2 protects mitochondrial decay by oxidative stress[J]. FASEB J,2015, doi:10.1096/fi.14-268904.

12Biswal S, Thimmulappa RK, Harvey CJ. Experimental therapeutics of Nrf2 as a target for prevention of bacterial exacerbations in COPD[J]. Proc Am Thorac Soc,2012, 9:47.

13Kim SJ, Park C, Han AL, et al. Ebselen attenuates cisplatin-induced ROS generation through Nrf2 activation in auditory cells[J]. Hear Res,2009, 251:70.

14中華醫學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會,中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員. 突發性聾的診斷和治療指南[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2015, 50: 443.

15Capaccio P, Pignataro L, Gaini LM, et al. Unbalanced oxidative status in idiopathic sudden sensorineural hearing loss[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol,2012,269:449..

16Yang CH, Ko MT, Peng JP, et al. Zinc in the treatment of idiopathic sudden sensorineural hearing loss[J]. Laryngoscope,2011,121:617.

17Wiegman CH, Li F, Clarke CJ, et al. A comprehensive analysis of oxidative stress in the ozone-induced lung inflammation mouse model[J]. Clin Sci (Lond), 2014 ,126:425.

18王璐, 丁大連, 孫虹,等. 對內耳氧化抗氧化失衡的反思[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2013, 22:965.

19Chang J, Jung HH, Yang JY, et al. Protective effect of metformin against cisplatin-induced ototoxicity in an auditory cell line[J]. J Assoc Res Otolaryngol,2014,15:149.

20Du Z, Yang Y, Hu Y, et al. A long-term high-fat diet increases oxidative stress, mitochondrial damage and apoptosis in the inner ear of D-galactose-induced aging rats[J]. Hear Res,2012, 287:15.

21Hielscher A, Gerecht S. Hypoxia and free radicals: Role in tumor progression and the use of engineering-based platforms to address these relationships[J]. Free Radical Biology and Medicine,2015,79:281.

22Riva C, Donadieu E, Magnan J, et al. Age-related hearing loss in CD/1 mice is associated to ROS formation and HIF target proteins up-regulation in the cochlea[J]. Exp Gerontol,2007, 2:327.

23Ito K, Hanazawa T, Tomita K, et al. Oxidative stress reduces histone deacetylase2 activity and enhances IL-8 gene expression: role of tyrosine nitration[J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,315:240.

24Adenuga D, Caito S, Yao H, et al. Nrf2 deficiency influences susceptibility to steroid resistance via HDAC2 reduction[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,403:452.

25Mercado N, Thimmulappa R, Thomas CM, et al. Decreased histone deacetylase 2 impairs Nrf2 activation by oxidative stress[J]. Biochem Biophys Res Commun,2011, 406:292.

(2015-09-14收稿)

(本文編輯李翠娥)

·臨床研究·

Study of the Expression of Nrf2 in Peripheral Blood Mononuclear Cells From Sudden

Deafness Patients Treated with Methylprednisolone

Qi Hui, Dai Yanhong, Hou Jie, Zhou Qiongqiong, Wei Xianmei, Yang Ye, She Wandong

(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, the Affiliated Drum Tower

Hospital, Medical School of Nanjing University,Nanjing,210008,China)

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the expression of Nrf2 and the relationship in patients with sudden deafness.MethodsPBMCs were collected from 10 hearing normal volunteers (control group) and 30 sudden sensorineural hearing loss patients before and after treatment with methylprednisolone for 10 days. We divided the SSNHL patients into 2 groups (Initial treatment group and difficult-to-treat group)according to their visit time and treatment way. We also divided the difficult-to-treat SSNHL patients into 2 groups(GC sensitive group and GC insensitive group)according to their hearing recovery. Quantitative Real Time PCR was used to detect the expression level of Nrf2 mRNA in PBMCs. The data were analyzed with SPSS 18.0 software.ResultsBefore accept treatment, the expression level of Nrf2 mRNA in PBMCs from Initial treatment group and difficult-to-treat group were below

*國家自然科學基金(81271074)，江蘇省臨床醫學科技專項(BL2014002),江蘇省第十批“六大人才高峰項目”(WSN-009)，南京市國際聯合研究項目(2012sd311038)聯合資助

1南京大學醫學院附屬鼓樓醫院耳鼻咽喉科(南京210008)

control group whereas there was no obvious difference between the two groups. The Nrf2 mRNA expression in GC sensitive group increased whereas The Nrf2 mRNA expression in GC insensitive group had no obvious change after 10 days treatment with methylprednisolone.ConclusionNrf2 may take part in the generation and development in SSNHL. Difficult-to-treat SSNHL with corticosteroid in-sensitivity may have relationship with the lower Nrf2 expression. We speculate that increasing the expression of Nrf2 may improve the effect of glucocorticoids and has a positive effect for hearing improvement.

【Key words】SSNHL;Glucocorticoid resistance;Nrf2;PBMCs

通訊作者：佘萬東(Email:shewandong@163.com)

作者簡介：齊慧，女，安徽人，研究生，主要研究方向為聽力學基礎與臨床。

【中圖分類號】R764.43+3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)01-0001-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.001