模擬中長期微重力和噪聲環境對大鼠聽功能及內耳毛細胞凋亡的影響△

陳娜　吳瑋，　韓浩倫　王剛　周麗斌　王鴻南　李保衛　丁瑞英　劉鋼

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模擬中長期微重力和噪聲環境對大鼠聽功能及內耳毛細胞凋亡的影響△

陳娜1吳瑋1，2韓浩倫2王剛2周麗斌2王鴻南2李保衛2丁瑞英2劉鋼3

【摘要】目的研究模擬中長期微重力和噪聲環境對大鼠聽功能及內耳細胞凋亡的影響。 方法36只SD大鼠隨機分為兩組：空白組(6只)和實驗組(30只)。實驗組給予持續尾部懸吊模擬微重力及飛船艙內噪聲(穩態噪聲+脈沖噪聲)暴露，分別于懸吊及暴露前、懸吊及暴露3天、1周、2周、4周和8周后檢測雙耳ABR反應閾，并于懸吊及暴露3天、1周、2周、4周和8周取實驗動物耳蝸行免疫組化染色觀察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)在內耳的表達?？瞻捉M不做任何處理，常規飼養，于實驗前及實驗3天、1周、2周、4周和8周分別檢測雙耳ABR反應閾，并于飼養8周后取耳蝸行免疫組化染色觀察。 結果實驗前兩組大鼠ABR反應閾差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組大鼠懸吊及噪聲暴露后各時間點ABR反應閾較空白組均明顯增高(P<0.01)，懸吊及暴露4周實驗組大鼠ABR反應閾為90.00±4.26 dB SPL，明顯高于3天、1周、2周及8周時(P<0.05)；懸吊及暴露8周大鼠ABR反應閾(80.00±5.22 dB SPL)有所下降，與暴露2周(85.00±4.77 dB SPL)、4周大鼠比較差異有統計學意義(P<0.01)。懸吊及噪聲暴露后大鼠內耳細胞caspase-3的表達較空白組明顯增強，且在一定時間內隨暴露時間的延長其表達有逐漸增強的趨勢，尤以懸吊及暴露4周時最明顯，暴露8周時其表達強度較4周時明顯下降。 結論模擬中長期微重力和噪聲環境對大鼠的聽功能有明顯損傷，且與內耳細胞凋亡呈相同的趨勢；微重力和噪聲因素造成的聽功能損傷可能與內耳細胞的凋亡有關。

【關鍵詞】微重力；噪聲；聽性腦干反應；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

網絡出版時間：2015-12-2815：14

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151228.1514.044.html

國外已有研究[1]證實，飛船內噪聲對宇航員聽覺有明顯的損傷作用，高達156 dB A[2]或190 dB A[3]的脈沖噪聲可造成一定的聽力缺失；早期的實驗[4]也證明，強度為98.0±2 dB A的風洞穩態噪聲可導致豚鼠聽損傷。但以上大多為短期實驗，研究的是獨立的模擬噪聲因素，而失重也是飛船飛行過程中存在的重要特殊狀態，其導致的聽力異常[5]將直接縮短宇航員的職業壽命并影響其生活質量。因此，本研究擬通過觀察模擬中長期微重力和噪聲環境對大鼠聽功能及內耳細胞凋亡的影響，探討噪聲和失重兩種因素同時作用造成聽損傷的可能機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組選取健康SD大鼠36只(由北京市海淀區興隆實驗動物養殖場提供)，均為雄性，體重180~200 g，耳廓反射靈敏，鼓膜標志清晰，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。隨機分為兩組：空白組(6只)和實驗組(30只)。

1.2實驗方法兩組大鼠均進行聽性腦干反應(ABR)測試，測試后實驗組給予持續尾部懸吊模擬微重力及飛船艙內噪聲(穩態噪聲+脈沖噪聲)暴露，分別于懸吊及噪聲暴露3天、1周、2周、4周和8周后檢測雙耳ABR反應閾，并于暴露3天、1周、2周、4周和8周取實驗動物耳蝸行免疫組化染色觀察caspase-3在內耳的表達?？瞻捉M不做任何處理，常規飼養8周，于3天、1周、2周、4周和8周檢測雙耳ABR反應閾，并于飼養8周后取耳蝸行免疫組化染色觀察。

1.2.1模擬失重方法實驗組大鼠采用目前最常用的頭低位模擬失重法[6](Morey-Holton法)進行持續尾部懸吊模擬微重力實驗，動物分為5組，每組6只，分別懸吊3天、1周、2周、4周及8周，尾部利用膠帶纏于懸吊的鐵絲上，保持動物頭低位，后肢完全離地，前肢承擔部分身體重量，身體縱軸與水平面呈30°夾角；懸吊期間保證動物可以自由活動、自由進食。

1.2.2噪聲暴露方法穩態噪聲由白噪聲信號發生器(UZ-3型)發出，經均衡器(MEQ)、功率放大器(PA-1000)傳到揚聲器(YZ20-7)，并將揚聲器放置于大鼠籠前部；穩定噪聲聲強用BK2250手持式分析儀測量，測得其聲強為72±2 dB SPL；脈沖噪聲由氣動激波管產生傳到傳聲器(BK4136)，峰值聲強為160 dB SPL，有效持續時間為30 ms，發數為3，重復間隔為1 min；脈沖噪聲聲強由BK2209精密脈沖聲級計測量，用TDS2022數字示波器記錄波形。每天持續給予實驗組動物8小時穩態噪聲暴露，按照每個時間點5只動物分別暴露3天、1周、2周、4周、8周，于每個時間點穩態噪聲暴露結束后各組分別給予脈沖噪聲暴露一次(含3 發)。

1.2.3ABR測試各組大鼠給予咪唑安定(80 mg/kg)和鹽酸賽拉嗪注射液(200 mg/kg)進行肌肉注射麻醉(麻醉深度達角膜反射消失，必要時給予總量的20%~30%維持)，應用聽性腦干反應儀在隔聲靜電屏蔽室內檢測短聲誘發(濾波帶寬80～3 000 Hz，疊加1 024次，掃描10 ms)的雙耳ABR反應閾，顱頂為記錄電極，測試耳為參考電極，鼻尖處為地線；刺激強度為5～97 dB SPL，間隔5 dB，以重復性好、比較穩定的波Ⅲ為標準判斷反應閾。測試及麻醉復蘇過程中保持環境溫度在38 ℃左右并用熱水瓶保持大鼠體溫恒定。

1.2.4形態學及免疫組化觀察方法動物于相應時間點行ABR檢測后取耳蝸，將一側耳蝸置于4%多聚甲醛液中，在解剖顯微鏡下摘除鐙骨，用細針于蝸頂鉆一小孔，將4%多聚甲醛緩慢灌流蝸管內并置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱過夜后用PBS漂洗3次，10%EDTA脫鈣2周，耳蝸石蠟包埋，平行連續切片，每片厚度3~5 μm，分別做HE染色及caspase-3(caspase-3抗體來自于美國abcam公司)免疫組化觀察，免疫組化顯色結果由2名以上病理科技師進行雙盲判定。

1.3統計學方法數據采用SPSS 19.0統計學軟件處理，各組ABR反應閾比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組ABR反應閾比較(表1)實驗前各組ABR反應閾差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組大鼠懸吊及噪聲暴露后各時間點ABR反應閾較空白組均明顯增高(P<0.01)，懸吊及噪聲暴露4周的大鼠ABR反應閾最高，與暴露3天、1周、2周及8周的大鼠ABR反應閾比較差異有統計學意義(P<0.05)；暴露8周大鼠的ABR反應閾有所下降，與暴露2周、4周大鼠比較,差異有顯著統計學意義(P<0.01)。

±s)

注：*與空白組同時間點比較，F=82.91，P<0.01；△與實驗組其他各時間點比較，P<0.05；#與實驗組2周、4周比較，P<0.05

2.2各組耳蝸Corti器HE染色結果空白組大鼠Corti器毛細胞完好且排列較為整齊，實驗組大鼠耳蝸Corti器毛細胞均有不同程度的紊亂甚至缺失，且懸吊及噪聲暴露時間越長，大鼠Corti器的損傷越明顯(圖1)。

2.3各組內耳細胞內凋亡標志物caspase-3免疫組化觀察結果空白組Corti器毛細胞結構完整清晰，且無caspase-3的陽性表達；實驗組Corti器均有caspase-3的陽性表達，且一定范圍內暴露時間長的動物陽性表達更加明顯，尤以暴露4周的大鼠陽性表達最強(圖2)。

空白組螺旋韌帶和血管紋上caspase-3為陰性表達，實驗組該部位caspase-3均為陽性表達，且在一定時間內表達程度隨時間而漸強；與陽性最強的暴露4周大鼠相比，暴露8周的大鼠caspase-3的表達略有下降但仍明顯強于空白組(圖3)。

空白組螺旋神經節中caspase-3為陰性表達，實驗組螺旋神經節均為陽性表達，且在一定時間內隨暴露時間的延長而有逐漸增強的趨勢，暴露4周的大鼠陽性表達最強，暴露8周的大鼠表達弱于暴露4周大鼠(圖4)。

3討論

以往對聽覺系統損傷的研究[7，8]大多集中于噪聲環境下，多數是針對單純噪聲環境對聽功能的影響，少有模擬噪聲聯合失重的復合環境。而失重也是飛船中重要的狀態，會給人體各種器官造成影響[9,10]，以往的實驗認為，失重因素對于聽覺系統的影響雖不及噪聲明顯，但仍能造成一定的聽力損傷[11]。為此，本實驗模擬穩態、脈沖噪聲及微重力的復合環境，以期更貼近飛船中的真實環境。

既往研究證實，噪聲會引起人體各系統的損傷[12]，特別是聽覺系統，甚至可以造成不可逆的永久性聽損傷。程浩等[13]認為，持續暴露在較高水平的噪聲中(主頻率在0.8 kHz以上)會損傷內耳的聽覺細胞，產生不可逆的聽損傷。從文中結果看，實驗組各時間點ABR閾值均較空白組明顯增高，且在一定時間范圍內隨模擬失重與噪聲暴露時間的延長，聽損傷逐漸明顯。說明中長期暴露于飛船復合環境中，在一定時間范圍內可能會導致聽覺系統的損傷。另外，本研究結果顯示空白組第8周時ABR反應閾略有升高，可能與8周時正常大鼠聽覺出現老化現象或多次麻醉多次測聽有關。事先給予較低強度的噪聲暴露后，動物適應后會對更高強度的噪聲產生耐受，從而減少對聽覺系統的損傷程度，這種效應即為噪聲習服[14]，Miller等[15]在栗鼠及其它動物身上均證明了這種現象。從文中結果可見懸吊及噪聲暴露4周的實驗組大鼠ABR反應閾最高，8周組ABR反應閾有所下降，可見長期(8周)暴露于模擬穩態、脈沖噪聲和微重力復合環境中的動物，聽損傷較輕且有所恢復；可能是由于大鼠暴露于模擬微重力及持續穩態噪聲(72±2 dB SPL)環境中，對該環境產生習服，減輕了穩態噪聲后給予的脈沖噪聲(160 dB SPL)造成的聽損傷，對聽覺有一定保護作用，使得ABR反應閾有所降低。其次，聽覺中樞在持續穩態噪聲暴露之后呈現一定的可塑性，朱小青等(2014)釆用電生理學離體腦片技術，觀察持續噪聲暴露(65 dB SPL)對誘導大鼠聽皮層長時程增強效應的影響，結果顯示連續噪聲暴露改變了聽皮層(后部)的突觸可塑性，呈現類似于成長發育期的“重啟”階段，使聽覺中樞在一定程度上得到重塑?？紤]懸吊及噪聲暴露8周的動物處于穩態噪聲及微重力環境的時間長于其他時間點動物，噪聲習服對脈沖造成的聽損傷的保護作用最明顯，并且誘導的長時程增強效應更加明顯，從而導致8周組大鼠ABR反應閾比4周、2周組有所降低。

圖1　空白組及實驗組不同時間點內耳Corti器HE染色結果(×40)

圖2　空白組及實驗組不同時間點內耳Corti器caspase-3免疫組化染色結果(×40)

噪聲所致的聽覺系統損傷與內耳Corti器及螺旋神經節等細胞的凋亡有關。細胞凋亡是為維持內環境穩定，在多基因控制下主動進行的復雜但有序的死亡過程，雖然目前還不確定對凋亡過程的調控機理，但國內外研究[16~18]已經證實caspase水解酶家族(caspase-3、caspase-8等)、Fas、bcl-2家族等在凋亡過程中發揮了重要作用。生物體內有多個信號可以誘導細胞凋亡，其共同的特征之一就是在凋亡早期這一系列細胞內蛋白水解酶的活化；通過對caspase-3的定性檢測可以了解細胞凋亡的程度和時間。caspase-3以無催化活性的酶原形式存在于胞質中，當細胞進入凋亡過程時，它去除N端前肽，進入活化第一步，經由特異的Asp殘基處的蛋白水解作用而被激活，從而產生了由蛋白水解作用形成的caspase-3自我放大級聯反應，開啟細胞內的死亡程序，進而裂解DNA降解產物損傷細胞[18]；凋亡程序一旦開始，便激活級聯反應，發生不可逆的凋亡。Hu等[19]將灰鼠暴露在110 dB SPL 4 kHz的窄帶噪聲環境中1 h后，發現耳蝸Corti器存在大量缺失、凋亡和壞死的細胞，同時還觀察到caspase-3在Corti器中呈陽性表達，與本實驗結果一致。本實驗顯示凋亡標志物caspase-3在空白組內耳細胞的表達為陰性，在實驗組內耳細胞的表達為陽性，且在一定時間范圍內暴露時間越長其表達越明顯，尤以4周組大鼠陽性表達最強，說明一定時間范圍內內耳細胞凋亡程度與噪聲累積量成正比，8周組大鼠其陽性表達較4周組弱，與聽功能檢測結果一致。吳瑋等[20]研究顯示，噪聲習服可減少外毛細胞纖毛團狀變和內毛細胞靜纖毛的缺失脫落，從而有效減輕高強度風洞噪聲對動物聽器官的損傷。文中暴露8周的大鼠內耳細胞caspase-3陽性表達較4周弱，可能與穩態噪聲暴露的持續時間不同有關，經過了8周持續穩態噪聲暴露，給予脈沖噪聲時大鼠內耳毛細胞的凋亡程度變弱；相對于8周組，4周及更短時間組大鼠給予穩態噪聲的時間較短，習服效應較弱，對聽覺損傷的保護效應就隨之減弱。

圖3　空白組及實驗組不同時間點內耳血管紋和螺旋韌帶caspase-3免疫組化染色結果(DAB法×40)

圖4　空白組及實驗組不同時間點內耳螺旋神經節caspase-3免疫組化染色結果(DAB法×40)

總之，本研究結果顯示，模擬中長期微重力和噪聲環境下大鼠聽力有一定程度的損傷，且在一定時間范圍內暴露時間越長的動物聽損傷越明顯，且ABR反應閾與caspase-3在內耳的表達水平相一致。提示長期暴露于飛船環境中可造成一定程度的聽損傷，噪聲習服會減輕一部分聽覺的損傷，因此，可以考慮合理利用噪聲習服的作用減少聽覺損害。此類聽損傷與內耳毛細胞凋亡有關，可以通過終止或者延緩內耳細胞凋亡減輕聽覺的損傷，具有一定的實際意義，但對于聽覺損傷的機理及飛船工作人員的保障還有待進一步研究。

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(2015-03-27收稿)

(本文編輯雷培香)

·實驗研究·

The Effects of Mid-long Term Simulated Microgravity and Noises on the Auditory

Functions and the Cell Apoptosis in Inner Ear of Rats

Chen Na*， Wu Wei， Han Haolun， Wang Gang， Zhou Libin，

Wang Hongnan， Li Baowei， Ding Ruiying， Liu Gang

(*The 306thHospital of PLA-Peking University Teaching Hospital, Beijing,100101,China )

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of mid-long term simulated microgravity and noises on the auditory functions and the cell apoptosis in inner ear of rats. MethodsThirty-six rats were randomly divided into control group(n=6) and experimental group(n=30). The experimental group was exposed to 30°head down tilt as simulated microgravity and noises including steady-state noise which was 72±2 dB SPL and impulse noise up to 160 dB SPL of spaceship environment. The control group was kept in normal conditions without exposure to microgravity and noise. Bilateral auditory brainstem response (ABR) thresholds were tested before and after 3-days, 1-week, 2-weeks, 4-weeks and 8-weeks exposure, respectively, and examine expression of caspase-3(an apoptotic marker) in the inner ear hair cells by immunohistochemical staining.ResultsThe ABR thresholds of all rats had no differents before experiment(P>0.05). The experimental group was significantly higher than those of in control group(P<0.01). The rats exposed to microgravity and noises for 4 weeks showed the highest ABR threshold

△全軍十二五重大課題子課題(AWS11J003)資助

1北京大學解放軍306醫院教學醫院(北京100101)；2解放軍306醫院耳鼻咽喉頭頸外科；3中國航天員科研訓練中心

shifts(86.25±4.83 dB) in the experimental group(P<0.05). After 8-weeks exposure, the rat ABR threshold shifts(74.10±5.45 dB) were lower and significantly lower than 2-weeks and 4-weeks(P<0.01). The damage has the same tendency with the cell apoptosis condition. The caspase-3 expression in the experimental group was positive in the inner ear cells. The expression had a growing tendency with the exposure time, especially after 4 weeks exposure. The expression of caspase-3 after 8-weeks exposure was significantly lower than 4-weeks. The auditory damage of 8-weeks exposure was significantly lower than 4-weeks and sound conditioning or certain recovery might have been involved.ConclusionThe environment of mid-long term simulated microgravity and inboard noises of spaceship leads to obvious damages to the auditory functions of the rats and it may caused by the cell apoptosis in the inner ear .

【Key words】Microgravity;Noise;Auditory brainstem response;Cell apoptosis;Caspase-3

通訊作者：吳瑋(Email：entwuwei@126.com)

作者簡介：陳娜，女，山東人，碩士研究生，主要研究方向為特種耳科學及臨床。

【中圖分類號】R764.43+3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)01-0039-06

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.010