低頻強聲對巴馬香豬聽功能及耳蝸毛細胞表面結構的影響

徐海艷　吳瑋,　王剛　韓浩倫　李保衛　王鴻南　劉旭

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低頻強聲對巴馬香豬聽功能及耳蝸毛細胞表面結構的影響

徐海艷1吳瑋1,2王剛2韓浩倫2李保衛2王鴻南2劉旭2

【摘要】目的了解高強度低頻率噪聲(低頻強聲)對巴馬香豬聽功能及耳蝸毛細胞表面結構的影響。方法將8只巴馬香豬隨機分為對照組(2只)及實驗組(6只)，均于實驗前行聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)檢測后，將實驗組再分為噪聲暴露后即刻、36小時及84小時組，每組2只；實驗各組動物暴露于50 Hz、142 dB SPL的低頻噪聲中5 min，再于暴露后即刻、36小時、84小時分別行ABR檢測，然后分別在掃描電鏡下觀察各組動物耳蝸毛細胞表面結構的形態變化。對照組不給予噪聲暴露，其他步驟同實驗組。結果8只(16耳)巴馬香豬低頻強聲暴露前ABR反應閾值為91.25±10.72 dB SPL；實驗組低頻強聲暴露后即刻、36 h及84 h所有動物雙耳ABR均未能引出。實驗組噪聲暴露后即刻掃描電鏡下可見內外毛細胞氣球樣變，外毛細胞靜纖毛融合及散在性缺失；噪聲暴露后36 h可見內外毛細胞輕度氣球樣變、靜纖毛散亂；噪聲暴露后84 h可見耳蝸底回內外毛細胞缺失，中回及頂回內外毛細胞靜纖毛缺失，且以第三排外毛細胞靜纖毛缺失最重；噪聲暴露后聽毛細胞表面結構損傷以基底回和中回為主，頂回損傷較輕。結論50 Hz、142 dB SPL噪聲暴露后巴馬香豬雙耳ABR反應閾值較暴露前明顯升高；掃描電鏡下可見內、外毛細胞靜纖毛融合、散亂及缺失等改變。

【關鍵詞】低頻強聲；巴馬香豬；聽性腦干反應；毛細胞

網絡出版時間：2015-12-2815：13

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151228.1513.024.html

噪聲是一種普遍存在于生活、職業環境中的有害因素，可導致人體心血管系統、消化系統、內分泌系統等多方面的損害，對聽覺系統的危害是最顯著及最特異的[1，2]。由于模擬低頻率高聲壓級噪聲發生裝備受限，目前大多研究主要關注高頻噪聲對嚙齒類動物聽功能的影響及其噪聲損傷的發生機制。而人類的生活環境中普遍存在低頻噪聲，且低頻噪聲具有衰減慢、聲波長及較易穿越障礙物的特點，對人體的影響比高頻噪聲更長遠[3]。因小型豬解剖結構與人類相似，目前已廣泛應用于心血管系統、皮膚及糖尿病的研究，且近期研究發現小型豬作為哺乳動物出生時耳蝸已發育成熟，其中耳及內耳解剖及發育特點與人類極其相近[4]，因此，本研究擬探討低頻強噪聲暴露對巴馬香豬耳蝸毛細胞表面結構及聽功能的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組取外耳道潔凈的健康巴馬香豬(第三軍醫大學實驗動物中心提供)8只，6月齡，體重10~20 kg，雌雄各半，分為對照組2只， 實驗組6只，實驗組再分為噪聲暴露后即刻、36 h、84 h組，每組各2只。

1.2低頻強噪聲暴露方法由動力源、低頻信號發射器、功率放大器和聲源發生器組成(第三軍醫大學實驗動物中心提供)發聲設備，在聲場內發出50 Hz、142 dB SPL低頻強聲(窄帶噪聲)，將實驗各組巴馬香豬置于該低頻強聲聲場(各處聲壓級相同)內，持續暴露5 min。對照組不給予噪聲暴露，其他飼養條件與實驗組相同。

1.3聽性腦干反應(ABR)測試于實驗前各組動物在隔聲靜電屏蔽室內進行雙耳ABR檢測，實驗各組分別于噪聲暴露后即刻、36 h、84 h行雙耳ABR檢測。測試方法：3%戊巴比妥(1 mg/kg)耳緣靜脈麻醉后顱頂正中接記錄電極，測試耳參考電極，鼻尖處接地極，單耳閉合聲場給聲；刺激聲為短音，帶通濾波為100～3 000 Hz，信號放大100 000倍，刺激重復率21.1次/秒，聲刺激持續時間100 μs，間歇期10 ms，疊加1 024次；刺激聲強度從125 dB SPL開始，先以10 dB遞減，接近反應閾時以5 dB遞減，至剛好出現波形，再重復一次，以能重復出現穩定的波V判斷為ABR反應閾值；如果125 dB SPL不能引出反應閾則默認其閾值為130 dB SPL。測試時注意動物保溫。

1.4耳蝸毛細胞掃描電鏡觀察實驗各組完成聽性腦干反應檢測后，迅速斷頭，用顱骨鉆于顱頂打孔，咬骨鉗將頂骨去除，完整剝離腦組織后，自顱底取出聽泡，挑出鐙骨后，暴露卵圓窗，用2.5%戊二醛溶液耳蝸內灌流固定,然后用灌注磷酸緩沖液(pH=7.4)沖洗，一側耳蝸置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃保存，用雙氧水沖洗，再經1%四氧化鋨后固定，雙氧水沖洗，梯度酒精脫水，臨界點干燥，離子濺射真空鍍膜，Hitachi S4800掃描電鏡(北京理化分析測試中心提供)下觀察基底膜內外毛細胞結構的變化。對照組完成ABR測試后同法取耳蝸掃描電鏡觀察。

2結果

2.1各組巴馬香豬噪聲暴露前后ABR反應閾比較實驗前8只巴馬香豬(16耳)ABR反應閾為80~110 dB SPL，其中，左耳分別為90、105、80、105、80、80、90、110 dB SPL，右耳分別為80、105、95、85、80、90、85、100 dB SPL，16耳平均值為91.25±10.72 dB SPL；噪聲暴露后實驗組6只(12耳)動物ABR反應閾均未引出。

實驗各組巴馬香豬經低頻強聲暴露后耳蝸毛細胞表面結構產生改變，如毛細胞氣球樣變、靜纖毛倒伏融合、基底板破裂等。噪聲暴露即刻組基底回(圖1b)內毛細胞氣球樣變，外毛細胞靜纖毛散亂及散在性缺失；中回(圖2b)內毛細胞氣球樣變，外毛細胞靜纖毛散亂融合，指突、柱細胞頭突起；頂回(圖3b)內毛細胞靜纖毛廣泛性散亂、倒伏、融合。噪聲暴露36 h組基底回(圖1c)內外毛細胞氣球樣變，中回(圖2c)內外毛細胞靜纖毛散亂，頂回(圖3c)內、外毛細胞輕度氣球樣變性。噪聲暴露84 h組基底回(圖1d)內外毛細胞廣泛性缺失；中回(圖2d)內毛細胞靜纖毛廣泛性缺失，外毛細胞氣球樣變及靜纖毛散亂、倒伏；頂回(圖3d)內外毛細胞氣球樣變?？梢妼嶒灨鹘M內、外毛細胞及其靜纖毛以基底回和中回損傷(特別是基底回)為主，輕者以內、外毛細胞氣球樣變及其靜纖毛散亂、倒伏為主，重者則出現嚴重的機械性損傷，如：內、外毛細胞靜纖毛廣泛性缺失甚至外毛細胞區表皮板破裂。

圖1　各組動物耳蝸基底回掃描電鏡觀察

a.對照組，內外毛細胞正常；b. 噪聲暴露后即刻組基底回：→內外毛細胞氣球樣變，↑外毛細胞散在缺失，第三層外毛細胞缺失較多，↓外毛細胞靜纖毛融合；c.噪聲暴露后36 h組基低回：↑內、外毛細胞氣球樣變為主；d.噪聲暴露后84 h組低基底回：內、外毛細胞缺失

圖2　各組動物耳蝸中回掃描電鏡觀察

a.對照組中回：內外毛細胞局限性輕度氣球樣變；b.噪聲暴露后即刻組中回：↑內外毛細胞靜纖毛散亂,輕度氣球樣變，→指突、柱細胞頭突起；c.噪聲暴露后36 h組中回：↑內、外毛細胞靜纖毛散亂為主；d.噪聲暴露后84 h組中回：↑外毛細胞靜纖毛缺失

圖3　各組動物耳蝸頂回掃描電鏡觀察

a.對照組頂回：→外毛細胞氣球樣變,以第三層外毛細胞為主；c.噪聲暴露后即刻組頂回：內毛細胞正常,↑外毛細胞靜纖毛融合；c.噪聲暴露后36 h組頂回↑內、外毛細胞輕度氣球樣變；d.噪聲暴露后84 h組頂回：↑內、外毛細胞氣球樣變，以外毛細胞為主；↓內毛細胞靜纖毛局限性缺失

3討論

目前在噪聲對聽功能影響的研究方面普遍選用豚鼠或小鼠制備動物模型，但嚙齒類動物的聽覺系統是出生后發育成熟的，且與人存在明顯的種屬差異；而小型豬作為哺乳動物與人類耳蝸在胚胎期的發育過程相似，出生時耳蝸已發育成熟，且小型豬的面神經的走形、鼓索神經分支的發出部位、三塊聽小骨的排列與人耳相似[4]；因此，小型豬也可作為中耳及內耳相關研究的良好動物模型。

動物的種屬差異及月齡[5]大小可能會影響ABR反應閾，2月齡黑色貴州小型豬聽性腦反應閾為25~35 dB[6]，1月齡榮昌豬及5~7周齡的越南小型豬ABR反應閾為40~50 dB SPL[5，7]；10~60日齡的巴馬香豬ABR反應閾為25~30 dB SPL[8]。本研究選用的6月齡巴馬香豬正處于青春期階段[9]，噪聲暴露前巴馬香豬雙耳平均ABR反應閾為91.25±10.72 dB SPL，ABR閾值較高可能與本實驗選用的小型豬為6月齡較其他實驗者所用動物月齡大有關。

王建軍等[10]認為100 Hz、130 dB SPL的低頻強聲持續暴露4 h對豚鼠耳蝸毛細胞無明確的損傷，但開啟了凋亡的程序。從本研究結果看，對照組內、外毛細胞靜纖毛和豚鼠毛細胞靜纖毛相比長短不齊，頂端毛細胞靜纖毛比基底回的靜纖毛長，和人耳蝸超微結構相類似[11]；實驗各組耳蝸內、外毛細胞及其靜纖毛的病理改變在耳蝸基底回、中回、頂回依次減輕，且以第三排外毛細胞及靜纖毛損傷最重；該表現和既往關于高強度低頻穩態噪聲對大鼠耳蝸損傷的規律相似[12]。本實驗觀察到了低頻強聲對巴馬香豬耳蝸產生了明顯不可逆性的機械性損傷，與王建軍等[10]實驗結果有所不同，可能與該實驗所用130 dB SPL的噪聲[10]低于本實驗所選用的142 dB SPL噪聲聲強有關。

Chen等[13]將大鼠置于115 dB、中心頻率13.6 kHz噪聲環境持續暴露4 h發現動物噪聲性聽力損傷程度和基底膜內、外毛細胞的缺失密切相關，噪聲暴露后存活的毛細胞功能基本正常，而受損傷甚至缺失的毛細胞幾乎死亡；一定數量的有功能的毛細胞是聽覺敏感性的前提條件。豚鼠經166 dB的連續脈沖噪聲暴露后出現耳蝸毛細胞靜纖毛的折斷、倒伏及表皮板的穿孔，以上結構的改變是形成永久性閾移的原因之一[14]。從本研究結果看，噪聲暴露后84 h動物的基底回內、外毛細胞出現廣泛性缺失；噪聲暴露后不同時間各組耳蝸損傷輕者以內、外毛細胞氣球樣變及其靜纖毛散亂、倒伏為主，重者則出現內外毛細胞廣泛性缺失甚至外毛細胞區表皮板破裂等嚴重的機械性損傷；噪聲暴露后實驗各組動物ABR反應閾均未引出，因此推測低頻強聲暴露后巴馬香豬雙耳聽性腦干反應閾上移與其內耳結構的不可逆性機械性損傷相關。

綜上所述，6月齡正常巴馬香豬ABR反應閾平均為91.25±10.72 dB SPL，經低頻強噪聲暴露后雙耳聽性腦干反應閾值明顯上移，掃描電鏡下可見耳蝸聽毛細胞靜纖毛融合、散亂及缺失等改變，且以基底回及中回損傷為主。今后擬增加樣本量進一步探討低頻強聲對耳蝸的損傷機制。

參考文獻4

1岳振忠.職業性噪聲聽力損傷[J].工企醫刊, 2007, 20: 52.

2劉素香.中低頻噪聲對電力生產工人健康影響的調查研究[J].職業與健康,2003, 19: 3.

3孟蘇北.城市住宅區低頻噪聲對人類健康的危害[J].中國醫藥導報,2007, 4: 17.

4侯赟, 郭維維, 楊仕明, 等.小型豬內耳發育形態學觀察[J].中華耳科學雜志, 2012, 10: 485.

5Guo WW, Cheng L, Liu HZ, et al. Hearing and Cochlear structures in a Swine Model[J].Journal of Otology, 2010, 5: 97.

6張雪茹, 楊仕明, 李登科, 等.不同濃度Ouabain對貴州小型豬內耳形態及聽力的影響[J].中華耳科學雜志,2013, 11: 279.

7Strain G, Tedford B, Gill M,et al. Brainstem auditory evoked potentials and flash visual evoked potentials in Vietnamese miniature pot-bellied pigs[J]. Research in Veterinary Science, 2006, 80: 91.

8謝雅芳, 馬龍, 趙立東. 小型豬與人類聽性腦干電位的特性比較[J].中華耳科學雜志， 2014, 12: 485.

9盧晟盛，羅龍興，郭亞芬，等.廣西巴馬小型豬不同年齡生殖激素水平的分析[J].實驗動物科學，2007,24：34.

10王建軍, 馮勃.高強度低頻穩態噪聲對豚鼠聽力及耳蝸毛細胞的影響[J].中華耳科學雜志, 2013, 11: 104.

11孫建和, 楊偉炎, 方耀云, 等.人Corti，s器掃描電鏡觀察[J].中華耳科學雜志, 2003, 1: 19.

12王剛, 吳瑋, 屈昌民, 等.高強度低頻穩態噪聲對大鼠耳蝸形態和功能影響的研究[J].中華耳科學雜志, 2014, 12: 360.

13Chen GD, Fechter LD. The relationship between noise - induced hearing loss and hair cell loss in rats[J]. Hear Res, 2003, 177: 81.

14Gao WY，Ding DL，Zheng XY，et al．Changes in the stereocilia and non-monotonic pattern threshold shift after exposure to impulse noise[J]．Hear Res，1991，54：296.

(2015-03-25收稿)

(本文編輯周濤)

·實驗研究·

The Effects of Intense Low Frequency Noise on Hearing Functions and

Hair Cell Surface Structures in Bama Pigs

Xu Haiyan*, Wu Wei, Wang Gang, Han Haolun, Li Bao wei, Wang Hongnan, Liu Xu

(*Chinese PLA Medical School, Beijing,100853,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of intense low frequency noise on hearing functions and hair cell surface structures in bama pigs.MethodsEight bama pigs were randomly divided into a normal control group(2 pigs) and experimental groups(6 pigs). Auditory brainstem response(ABR) was performed before and after noise exposure. The control group was not exposed to the noise but other conditions were the same as the experimental groups. The experimental groups(6 pigs) were randomly divided into immediate group,36 h group, and 84 h group(2 pigs per group),and then were exposed to intense low frequency noise at 142 dB,50 Hz for 5 min according to the three time points. ABR was tested again before the cochleas were collected at the different. The hair cell surface structures were examined with scanning electron microscope(SEM).ResultsFor 8 bama pigs(16 ears), the average ABR threshold before the noise exposure was 91.25±10.72 dB SPL, but they were not elicited after the exposure to the noise at the level of 142 dB,50 Hz for 5 min. The scanning electron microscopy showed inner/outer hair cells ballooning ,outer hair cell stereocillia fusion and sporadic deletion in the immediate group; 36 h group showed inner/outer hair cells ballooning , the outer hair cell scattered stereocillia;84 h group showed missing inner/outer hair cell in the basal turn, the middle and apical turns showed inner/outer hair cell missing stereocillia and greater damage in the third row .The hair cell surface structures showed greater damage in the basal and middle turn than apical turn.

1解放軍醫學院(北京100853)；2解放軍第306醫院耳鼻咽喉頭頸外科

ConclusionABR thresholds were elevated after noise exposure. SEM showed inner/outer hair cell stereocillia fusion/scattered and deletion etc.

【Key words】Low frequency noise;Bama pig;Auditory brainstem response;Hair cell

通訊作者：吳瑋(Email:entwuwei@126.com)

作者簡介：徐海艷，女，河南人，碩士研究生，主要研究方向為噪聲性聾。

【中圖分類號】R764.43+3

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)01-0045-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.01.011