紅景天口服液對大鼠心肌細胞缺氧耐受性的影響研究

姚卓賢，馮 凱

（江蘇省常州市第一人民醫院，江蘇 常州 213001）

紅景天口服液對大鼠心肌細胞缺氧耐受性的影響研究

姚卓賢，馮 凱

（江蘇省常州市第一人民醫院，江蘇 常州 213001）

目的 觀察紅景天口服液對大鼠心肌細胞缺氧耐受性的改善作用。方法 將40只雄性SD大鼠乳鼠，按體重隨機分為溶劑對照組、模型對照組、陽性對照組和紅景天組。溶劑對照組和模型對照組給予生理鹽水20 L／mL，陽性對照組給予氟桂嗪膠囊20 g／mL，紅景天組給予紅景天口服液20 L／mL。大鼠心肌細胞提取后常規培養10 d，更換不含胎牛血清的DMEM培養基，溶劑對照組在正常環境的培養箱中培養；模型對照組、陽性對照組和紅景天組心肌細胞放入溫度為37℃及CO2濃度為5%、O2濃度為1%的三氣培養箱中進行缺氧處理，缺氧時間為6 h。缺氧后收集細胞培養上清液，按試劑盒的要求分別測試乳酸脫氫酶、丙二醛、肌酸激酶、超氧化物歧化酶的水平。取余下細胞，按凱基細胞凋亡檢測試劑盒的要求用流式細胞儀測試細胞凋亡的情況，用MTT法測試心肌細胞的活力水平。結果 紅景天口服液能顯著提高大鼠原代培養心肌細胞在缺氧條件下的活力，減少細胞凋亡，效果優于陽性對照藥（P＜0．01）；并且可降低原代培養心肌細胞因缺氧所致心肌酶升高，有較好的清除氧自由基作用和對缺氧心肌細胞的保護作用，效果優于陽性對照藥(P＜0．01)。結論 紅景天口服液可明顯提高大鼠心肌細胞的缺氧耐受性，為臨床治療缺氧性心肌病提供理論依據及實驗資料。

紅景天口服液；大鼠；心肌細胞；缺氧；耐受性

紅景天(Rhodiola rosea)為景天科多年生草木或灌木植物，生長在海拔800～2 500 m高寒無污染地帶的珍稀野生植物。20世紀60年代蘇聯科學家發現，它具有適應原樣作用，可協助身體回復穩態，加強機體適應性，增強機體對物理、化學和生物學等各種有害刺激與損傷的非特異性抵抗力，使紊亂的機能恢復正?！，F代藥理研究表明[1]，紅景天具有抗缺氧、抗菌、抗氧化、提高免疫力等作用。為此，筆者觀察了紅景天口服液對大鼠心肌細胞缺氧耐受性的改善作用，旨在為臨床治療缺氧性心肌病提供理論依據及實驗資料。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

藥品與試劑：高山紅景天口服液（杭州華威藥業有限公司，批號為140701，規格為每支10 mL）；鹽酸氟桂利嗪膠囊（西安楊森制藥有限公司，批號為150306692，規格為每粒5 mg）；氯胰酶（Gibco公司分裝）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所，每瓶200 mL），5－Brud（sigma公司，上海浩然生物技術有限公司分裝，每瓶500 mg）；噻唑藍（MTT，AMRESCO 公司，批號為LJ0628A5010J）。乳酸脫氫酶(LDH)測試盒（南京建成生物工程研究所，批號為20130807）；丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號為20130731）；肌酸激酶（CK）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號為20131031）；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號為 20130813）；凱基 Annexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號為20130709）。

動物：雄性ICR清潔級大鼠乳鼠，由蘇州大學動物房提供。

儀器：MCO－15AC型CO2恒溫培養箱（SANYO公司），3131型三氣培養箱（Thermo Fisher Scientific公司），BCM－1000A型生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），L－500型低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），multiskan MK3型酶標儀（賽默飛世爾＜上海＞儀器有限公司），FACSCalibur型流式細胞儀（BD公司），電子計時器，1 mL注射器，密封廣口瓶。

1．2 方法

1．2．1 試驗分組與給藥

取雄性SD大鼠乳鼠40只，單籠喂養3 d后，按體重隨機分為溶劑對照組、模型對照組、陽性對照組和紅景天組。提取心肌細胞，溶劑對照組和模型對照組給予生理鹽水20 μL／mL，陽性對照組給予氟桂嗪膠囊20 μg／mL，紅景天組給予紅景天口服液20 μL／mL，正常環境培養10 d。

1．2．2 試驗方法

取2～3日齡SD大鼠乳鼠，放入75%酒精中浸泡消毒1 min，取出后開胸取心臟放入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS液)中。將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm小碎塊，并用PBS液反復洗滌。取用2．0 g／L的胰蛋白酶10 mL，37℃消化10 min，加入1 mL胎牛血清終止消化，200目網篩濾過，2 000 r／min離心取沉淀后用含 10%FBS、10%胎牛血清、1%青鏈霉素及0．1 mmol／L 5－Brud的 DMEM培養基接種于培養瓶中。37℃及5%的CO2、飽和濕度下培養貼壁1．0 h，收集未貼壁細胞，即為純度較高的心肌細胞。離心，計數后隨機接種在24孔板中，放在CO2恒溫培養箱中培養[2－4]。

心肌細胞常規培養10 d后，更換不含胎牛血清的DMEM培養基，溶劑對照組在正常環境的培養箱中培養。模型對照組、陽性對照組和紅景天組心肌胞放入溫度為37℃及CO2濃度為5%、O2濃度為1%的三氣培養箱中進行缺氧處理，缺氧時間為6 h。缺氧后收集細胞培養上清液，按試劑盒的要求分別測試LDH，MDA，CK，SOD的水平。取余下細胞，按凱基細胞凋亡檢測試劑盒的要求用流式細胞儀測試細胞凋亡的情況，用MTT法測試心肌細胞的活力水平。

1．2．3 檢測指標

細胞凋亡指數、細胞活力、細胞上清液酶學指標(LDH，MDA，CK，SOD)。

1．3 統計學處理

2 結果

2．1 對原代缺氧培養大鼠心肌細胞活力的影響

用MTT法檢測細胞活力發現，未經缺氧培養的大鼠心肌細胞(溶劑對照組)活力為0．923%，經過缺氧培養的大鼠心肌細胞(模型對照組)活力為0．303%，顯著低于未經缺氧的溶劑對照組(P＜0．05)，說明缺氧對培養心肌細胞活力有較大影響。陽性對照組和紅景天組心肌細胞的活力分別為0．359%和0．487%，說明紅景天口服液能提高缺氧培養的大鼠原代心肌細胞活力，與模型對照組比較心肌細胞活力升高非常顯著(P＜0．01)，效果優于陽性對照組。見表1。

表1 紅景天口服液口服對缺氧培養大鼠原代心肌細胞活力的影響(s，n＝10)

表1 紅景天口服液口服對缺氧培養大鼠原代心肌細胞活力的影響(s，n＝10)

注：與模型對照組比較， P＜0．05，＃P＜0．01。下表同。

組別溶劑對照組模型對照組陽性對照組紅景天組劑量( g／mL) 20 20細胞活力(%) 0．923±0．022 0．303±0．011 0．359±0．008 0．487±0．007＃

2．2 對原代缺氧培養大鼠心肌細胞凋亡的影響

對原代培養的大鼠心肌細胞經過凋亡檢測試劑盒處理后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果發現，溶劑對照組細胞凋亡指數為7．11%，模型對照組細胞凋亡指數為18．2%，陽性對照組和紅景天組分別為13．5%和12．3%，說明紅景天口服液能降低缺氧培養的大鼠原代心肌細胞凋亡指數，與模型對照組比較心肌細胞凋亡指數下降非常顯著(P＜0．01)，效果優于陽性對照組。見表2。

表2 紅景天口服液對缺氧培養大鼠原代心肌細胞凋亡的影響(s，n＝10)

表2 紅景天口服液對缺氧培養大鼠原代心肌細胞凋亡的影響(s，n＝10)

組別溶劑對照組模型對照組陽性對照組紅景天組劑量( g／mL) 20 20凋亡指數(%) 7．11±0．55 18．2±3．13 13．5±2．65 12．3±1．23＃

2．3 對原代缺氧培養大鼠心肌細胞上清液酶的影響

LDH與CK：模型對照組與溶劑對照組相比，LDH與CK顯著增加，說明常壓缺氧環境下對心肌細胞造成了嚴重的損傷。與模型對照組比較，陽性對照組和紅景天組的LDH和CK均有不同程度的降低，以LDH為例，模型對照組為1 544 U／L，陽性對照組為1 088 U／L，紅景天組為855 U／L，說明紅景天口服液對保護缺氧心肌細胞、減輕因細胞壞死造成心肌酶的溢出有較好的保護作用。見表3。

表3 紅景天口服液對原代缺氧培養大鼠心肌細胞酶學的影響(s，n＝10)

表3 紅景天口服液對原代缺氧培養大鼠心肌細胞酶學的影響(s，n＝10)

組別酶指標溶劑對照組模型對照組陽性對照組紅景天組LDH（U／L）622±188 1 544±323 1 088±345 855±238＃CK（U／mL）0．39±0．16 1．42±0．55 0．91±0．42 0．88±0．34＃MDA（nmol／mL）0．58±0．31 2．75±1．03 2．02±0．34 1．83±0．55＃SOD（U／mL）17．0±0．73 6．23±2．13 10．1±2．21 11．5±1．97

MDA與SOD：模型對照組與溶劑對照組相比，MDA含量顯著上升，SOD含量顯著下降，說明缺氧導致心肌細胞脂質過氧化，產生大量的脂質過氧化物，SOD的活性受到抑制。與模型對照組比較，陽性對照組和紅景天組培養細胞上清液中MDA濃度降低，SOD含量升高，說明紅景天口服液對培養心肌細胞缺氧引起的氧化應激有較好的保護作用。見表3。

3 討論

氧對維持機體生命活動十分重要，缺氧可對機體造成多方面的損害：首先將對中樞神經造成損傷，導致腦水腫甚至神經元不可逆壞死；導致心功能降低，微循環障礙，最終導致全身重要臟器的供血不足；還將產生大量的自由基，導致細胞功能嚴重受損，引發細胞凋亡。因此，提高缺氧耐受力，能有效保護缺氧損傷。

相關藥理學研究已證實，紅景天具有明顯改善心肌缺血缺氧、降低心肌耗氧量、保護損傷心肌等作用[5]。龍怡等[6]通過體外缺氧缺糖心肌細胞損傷模型，分別測定細胞MTT，LDH和MDA的變化，觀察紅景天單體成分紅景天苷、酪醇、沒食子酸、德欽紅景天苷、草質素－7－O－(3′－β－D－葡萄糖)－α－L－鼠李糖苷5種成分對心肌細胞損傷的保護作用，結果顯示，5種單體成分均有不同程度的促細胞活力，降低LDA和MDA的含量，其中單體成分紅景天苷、酪醇能明顯上調HIF－1α mRNA的表達。表明紅景天有明顯抗缺氧作用，5種單體成分對缺氧缺糖心肌細胞損傷具有明顯的保護作用，其機制與上調HIF－1αmRNA的表達相關。

本研究通過大鼠乳鼠心肌細胞缺氧培養試驗，分別從細胞水平和分子水平證實了紅景天口服液能提高大鼠乳鼠心肌細胞的缺氧耐受性。紅景天組可顯著增加缺氧心肌細胞的細胞活力，降低心肌細胞的細胞凋亡，且效果優于陽性對照組選擇的西藥氟桂利嗪；紅景天組能顯著降低CK，LDH的表達及MDA濃度，提高SOD表達，表明紅景天口服液能顯著降低氧化應激引發的脂質過氧化程度，具有顯著的缺氧心肌損傷的保護作用。故可認為，紅景天口服液提高缺氧耐受力的作用機制與降低脂質過氧化、保護缺氧心肌細胞損傷有關。

綜上所述，紅景天口服液能顯著提高大鼠原代培養心肌細胞在缺氧條件下的活力，減少細胞凋亡；并且能降低原代培養心肌細胞因缺氧所致心肌酶的升高，有較好的清除氧自由基的作用，顯示出對缺氧心肌細胞較好的保護作用。

[1]滕靜如，熊佳鵬，肖 誠，等．紅景天的現代藥理學研究進展[J]．中國中醫基礎醫學雜志，2006，12（4）：319－320．

[2]郝 然，婁金麗，張允嶺，等．參麥注射液對缺氧心肌細胞凋亡的影響[J]．中國病理生理雜志，2007，23（4）：660－663．

[3]余 偉，王 偉，陳純娟，等．白黎蘆醇對大鼠缺氧心肌細胞凋亡的保護作用及對SIRTI表達的影響[J]．中國老年心腦血管病雜志，2009，11（5）：365－368．

[4]李雪蓮，關會林，王 璐，等．丹參酮ⅡA調劑 microRNA－1保護缺氧心肌的作用[J]．現代生物醫學進展，2014，28（14）：5 463－5 466．

[5]王秋爽．大株紅景天注射液治療穩定型心絞痛的療效觀察[J]．中國保健營養，2013，23（8）:4 606．

[6]龍 怡，李佳川，孟憲麗．紅景天有效成分對缺氧缺糖心肌細胞損傷的保護作用研究[J]．中藥藥理與臨床，2010，26（1）：24－26．

Influence of Rhodiola Rosea Oral Liquid on the Hypoxia Tolerance of Rat Myocardial Cell

Yao Zhuoxian,Feng Kai
(Changzhou First People′s Hospital,Changzhou,Jiangsu,China 213001)

Objective To investigate the improvement of hypoxia tolerance of rat myocardial cells by Rhodiola rosea Oral Liquid．M ethods 40 male SD neonate rats were randomly distributed into 4 groups by their weights:solvent control group,model group,positive control group and the experimental group．The solvent group and the model group were treated with physiological saline(20 μL／mL), while the positive control group was treated with physiological saline capsule(20 μg／mL)and the experimental group with oral liquid of Rhodiola rosea(20 μL／mL)．The rat myocardial cells were cultured for 10 d in DMEM medium without fetal bovine serum．The solvent control group was cultured in incubator with normal conditions．The model group,positive control group and the experimental group were cultured in tri－gas incubat with 5% CO2and 1% O2at 37℃ for 6 h．Afterward,cell culture supernatant was harvested and analyzed through a number of assays．Based on the kit instruction,the levels of lactate dehydrogenase,malonaldehyde,creatine kinase,superoxide dismutase were subsequently measured．The rest cells were collected．The apoptosis of these cells was observed based on the Keki cell apoptosis detection kit instruction by flow cytometry,while the activity of these cardiac muscle cells was measured with the method of MTT．Results The whole experiment indicates that Rhodiola rosea Oral Liquid significantly increased the cell viability and reduced the cell death of rat primary cultured myocardial cells compared with positive control group(P＜0．01)．The assay performed indicated that the oral liquid of Rhodiola rosea lowered the myocardial enzymes level,which were induced by myocardial cell hypoxia and the levels of free radicals,showing that there was a better protective effect on hypoxic myocardial cells compared with positive control group(P＜0．01)．Conclusion Rhodiola rosea Oral Liquid can obviously improve the hypoxia tolerance of rat myocardial cells,and provide experimental data for the clinical treatment of hypoxic cardiomyopathy．

Rhodiola rosea Oral Liquid;rat;myocardial cells;hypoxia;tolerance

R285．5；R286

A

1006－4931(2016)09－0038－03

2015－10－14)