FRY蛋白在不同惡性程度乳腺腫瘤中的表達與意義*

費帆，張辰子，趙進明，陳華軍，李海南，楊林，任雪峰，衛秦芝，唐小江（.南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院，廣東廣州5055；.廣東省醫學實驗動物中心，廣東佛山588；.中山大學附屬第六醫院，廣東廣州50655；.廣東省韶關市第一人民醫院，廣東韶關5000）

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FRY蛋白在不同惡性程度乳腺腫瘤中的表達與意義*

費帆1，張辰子2，趙進明3，陳華軍4，李海南4，楊林2，任雪峰2，衛秦芝1，唐小江2
（1.南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學學院，廣東廣州510515；2.廣東省醫學實驗動物中心，廣東佛山528248；3.中山大學附屬第六醫院，廣東廣州510655；4.廣東省韶關市第一人民醫院，廣東韶關512000）

摘要：目的研究不同惡性程度的乳腺腫瘤病例中FRY蛋白的表達情況及其與臨床病理參數之間的關系。方法對收集的104例乳腺腫瘤病例（其中纖維囊性乳腺病11例，不同分級的乳腺浸潤性導管癌93例）中FRY蛋白的表達情況進行免疫組織化學檢測，比較FRY蛋白表達情況與乳腺腫瘤惡性程度及不同臨床病理參數之間的關系。結果11例纖維囊性乳腺病與93例乳腺浸潤性導管癌病例中FRY蛋白表達陽性率分別為90.9%和54.8%，差異有統計學意義（P<0.05）；93例乳腺癌病例中，FRY蛋白在乳腺癌不同組織分級、不同TNM分期、腫瘤直徑大小、PR水平間的表達均有顯著性差異（P<0.05）。結論FRY蛋白的表達與乳腺腫瘤的惡性程度相關，惡性程度越高，FRY蛋白表達越少，同時FRY蛋白的表達與體內激素受體水平也存在一定聯系。

關鍵詞：FRY；抑癌蛋白；乳腺腫瘤；惡性程度；免疫組織化學

乳腺癌是世界上第二常見的癌癥疾病，是女性最常見的癌癥疾病，近年來其發生率以每年約3% ～4%的速度增長[1]。乳腺癌相關分子標志物的檢測對于乳腺癌的診斷及預后和治療都有著重要的指導意義，通常根據雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）等的表達選擇不同方案進行系統性治療[2]。同時鉬靶X線及MRI檢查等影像技術的發展也為乳腺癌的早期診斷提供了有力的手段[3]。但乳腺癌的病因尚不完全清楚，因此還沒有確切從根本上預防乳腺癌的方法，加上其預后轉歸情況復雜，近年來尋找新的能對乳腺癌進行早期診斷和提示預后的分子標志物成為了研究熱點。

FRY基因是果蠅的furry基因在哺乳動物中的同源基因，與果蠅的毛發生長有關[4]。FRY基因在細胞增殖和分裂[5]、上皮細胞極化[6]以及細胞形態[7]等方面起調節作用。有研究表明，人FRY基因有可能成為一種新的乳腺癌抑癌基因，它的表達水平與乳腺癌的發生發展及惡性程度密切相關[8]，但目前FRY與乳腺腫瘤惡性程度的關系仍存在許多未知。故采用免疫組織化學方法對不同惡性程度乳腺腫瘤中FRY蛋白的表達進行檢測，探究FRY蛋白的表達與乳腺癌惡性程度及臨床病理參數之間的關系。

1　資料與方法

1.1樣本收集

收集廣東省韶關市第一人民醫院及中山大學附屬第六醫院乳腺科2010年1月-2012年11月收治并經確診的乳腺腫瘤石蠟組織標本104例。其中纖維囊性乳腺病11例，乳腺浸潤性導管癌病例93例，所有患者術前均未進行放化療，采用正電荷防脫玻片行常規4μm石蠟切片。

收集石蠟標本對應患者的基本信息及臨床資料。在104例病例中，乳腺非癌病例主要為纖維囊性乳腺病，11例，年齡24～50歲，平均45.32歲；乳腺癌病例主要為乳腺浸潤性導管癌，93例，年齡32～80歲，平均50.81歲；乳腺癌病例中，組織學分級參照病理報告信息，其中Ⅰ級7例，Ⅱ級47例，Ⅲ級39例；記錄腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移等情況，根據美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）指南TNM分期標準對各病例進行分期：I期27例，II期33例，III期22例，其中11例有部分信息缺失未能進行分期。記錄ER、PR、HER2等免疫組織化學結果，對各病例進行分子病理分型，其中管腔上皮A型（Luminal A型）23例，管腔上皮B型（Luminal B型）47例，HER2過表達型13例，三陰型乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC型）10例。

1.2材料與試劑

FRY單克隆抗體為本課題組前期研究制備，經前期實驗驗證適用于免疫組織化學檢測，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、枸櫞酸鈉緩沖液購自武漢博士德公司，SP-9000免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液、蘇木素染液購自北京中杉金橋生物技術公司，乙醇、二甲苯購自廣州中南化工試劑廠。

1.3方法步驟

SP法免疫組織化學檢測：60℃烤片1 h，置于二甲苯及梯度乙醇中脫蠟至水，于3%過氧化氫H2O2內10 min滅活組織內源性過氧化物酶活性；枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中進行微波修復，室溫自然冷卻，1×PBS緩沖液洗3次，每次5 min；滴加山羊血清封閉，傾倒封閉液，不洗，滴加制備的FRY單克隆抗體，4℃孵育過夜，1×PBS緩沖液洗3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，孵育15 min，1×PBS緩沖液洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，孵育15 min，1×PBS緩沖液洗3次，每次5 min；DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，脫水透明，并用中性樹膠封片。陰性對照選用1×PBS緩沖液代替一抗。

1.4免疫組織化學染色結果判定

選取400倍鏡下5個清晰視野進行觀察拍照，細胞的染色強度分為4級，0分：無染色；1分：弱染色；2分：中度染色；3分：強染色。陽性細胞數也分4級，0分：染色陽性細胞<5%；1分：染色陽性細胞5%～25%；2分：染色陽性細胞26%～50%；3分：染色陽性細胞>50%。每張切片計分為染色陽性細胞數計分與染色強度計分之和，0分為陰性-，1、2分為+，3、4分為++，5、6分為+++，取5個視野的平均值，以1、2分為FRY蛋白陰性表達，3、6分為FRY陽性表達。

1.5統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件對結果進行數據分析，采用χ2檢驗（或Fisher精確概率法）比較不同臨床參數之間FRY蛋白的表達差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同惡性程度乳腺腫瘤中FRY蛋白的表達情況

免疫組織化學結果顯示如附圖，FRY蛋白的表達主要在細胞核，染色為淺黃色至棕黃色不等。在良性乳腺腫瘤細胞中可見細胞核呈深棕黃色，且染色細胞比例較大；在乳腺癌組織中，癌細胞棕黃色較淺或不明顯，染色細胞較少；陰性對照全片無染色。

104例乳腺腫瘤中，11例纖維囊性乳腺病中FRY蛋白陽性表達為10例，陽性率90.9%；93例乳腺浸潤性導管癌中為51例，陽性率54.8%，乳腺良性腫瘤中FRY蛋白的陽性率明顯高于乳腺癌，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

附圖　不同組織學分級中FRY蛋白的表達情況（×400）

表1　良惡性乳腺腫瘤中FRY蛋白的表達情況

表2　FRY表達與乳腺癌臨床病理參數的關系

2.2乳腺癌不同臨床病理參數與FRY蛋白的表達情況

如表2所示，93例乳腺癌病例中，Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級FRY蛋白的陽性率分別為57.1%、72.3%及 33.3%，不同分級間FRY蛋白的表達水平差異有統計學差異（P<0.01）。在TNM分期中，分期較低的Ⅰ期與分期較高的Ⅱ期、Ⅲ期的FRY蛋白陽性率分別為74.1%和47.3%，不同分期間FRY蛋白的表達水平有顯著性差異（χ2=5.282，P<0.01）。在分子亞型中，Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達型、TNBC型的FRY蛋白陽性率分別為52.2%、61.7%、38.5%及50.0%，各組間差異無統計學意義（χ2= 2.462，P> 0.05）。腫瘤直徑大小≤3 cm的組中FRY蛋白陽性率比直徑大小>3 cm的組高，差異有統計學意義（χ2=8.939，P<0.01）。不同年齡段FRY蛋白的表達差異無統計學意義（χ2=0.031，P>0.05）。發生淋巴結轉移的病例比未發生淋巴結轉移的病例FRY蛋白表達水平要低，但無顯著性差異（χ2= 1.326，P>0.05）。

2.3FRY蛋白表達與乳腺癌相關分子標志物水平的關系

在93例乳腺癌病例中，FRY蛋白表達在ER陽性組和ER陰性組的陽性率分別為58.0%和45.8%，陽性組表達高于陰性組（χ2=1.059，P>0.05）；在PR陽性組和PR陰性組的陽性率分別為63.5%和35.7%，PR陽性組明顯高于PR陰性組（χ2=5.905，P<0.05）；在HER2陽性組和HER2陰性組的陽性率分別為56.7%和51.5%（χ2=0.228，P>0.05），在P53陽性組和陰性組的陽性率分別為62.8%和76.9% （P>0.05）。見表3。

表3　FRY表達與乳腺癌相關蛋白水平的關系

3　討論

乳腺癌的發生、發展是一個多因素參與和多階段的復雜過程[9]。乳腺癌作為一種異質性腫瘤，主要體現在臨床表現的多樣性、治療反應的不一致性及預后轉歸的差異性。通過對乳腺癌患者的臨床表現、生物學特征等各種因素的分析，從差異中找出規律，為臨床改進治療手段、改善預后轉歸提供有力的支持。

在收集的病例中，纖維囊性乳腺病的FRY蛋白陽性率要低于乳腺浸潤性導管癌，兩者差異有統計學意義，表明在乳腺良性腫瘤中FRY蛋白的表達要高于乳腺惡性腫瘤，結合FRY基因在細胞增殖和分裂、細胞形態等方面的調節作用，提示FRY基因可能是正常乳腺細胞中不可缺少的，FRY蛋白的表達有助于乳腺細胞的正常分化和增殖，乳腺癌病例中癌細胞的形成和發生可能與FRY蛋白表達偏低有關。

乳腺癌的組織學分級具有重要的預后意義[10]，分級越高腫瘤的分化越差,提示乳腺癌預后不良。各不同組織學分級間FRY蛋白的表達差異有統計學意義（P<0.05），但由于組織學Ⅰ級的病例僅有7例，在陽性表達率上并未高于Ⅱ級，考慮在后續工作中繼續增加這一部分樣本的收集和檢測；在例數相當的Ⅱ、Ⅲ級病例中，分級越高，FRY表達明顯降低。乳腺癌TNM分期也是臨床上較成熟的評估指標[11]。在已分期的82例乳腺癌病例中，隨著TNM分期的升高，FRY蛋白的陽性率均降低，差異有統計學意義（P<0.05），進一步驗證了在不同惡性程度的乳腺癌中，FRY蛋白的表達存在規律性，分級高、分期晚的乳腺癌FRY蛋白表達低。

目前臨床主要根據ER、PR及HER2的免疫組織化學檢測結果將乳腺癌分為4種分子亞型，即Luminal A型（ER+/PR+、HER2-）、Luminal B型（ER+/PR+、HER2+）、HER2過表達型（ER-、PR-、HER2+）、三陰型乳腺癌（TNBC，ER-、PR-、HER2-）。其中，Luminal A型和Luminal B型的預后較好，而三陰型乳腺癌和HER-2過表達型則預后較差[12]。結果雖然顯示FRY蛋白表達在各分子分型間的差異無統計學意義（P>0.05），考慮到樣本收集的均衡性，樣本來源于兩個不同地區的醫院，各醫院的檢測條件及評判程序可能存在差異性。但從FRY蛋白表達的陽性率可以看出Luminal A型和Luminal B型要高于三陰型乳腺癌和HER-2過表達型，仍可提示FRY蛋白表達在乳腺癌分子亞型中可能存在的趨勢性。

雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）是評價乳腺癌預后和指導內分泌治療的指標，ER、PR陰性者，屬于非激素依賴型，一般分化較差；HER2表達與ER、PR表達呈負相關，表達越高，乳腺癌的復發率越高，預后越差[13]。結果顯示PR陽性組中FRY蛋白表達率明顯高于PR陰性組（P<0.05），ER陽性組也高于ER陰性組（P>0.05），HER2陰性組與HER2陽性組差異無統計學意義（P>0.05）。雖然ER的FRY表達差異無統計學意義，但從數據可以看出，納入分析的病例中ER與PR均為93例，且ER、PR陰性組中FRY蛋白的陽性例數均為11例，ER、PR陽性組中FRY蛋白的陽性例數均為40例，具有高度的一致性，提示ER可能與PR跟FRY的關系一致。P53也是臨床上與乳腺癌關系較大的分子標志物之一[14]，收集的乳腺癌樣本中有56例病例具有P53檢查結果，但FRY表達情況在不同P53水平組見并未見顯著差異（P>0.05）。

腫瘤大小和淋巴結轉移情況是乳腺癌的重要預后指標[15]，腫瘤越大出現轉移的時間越短[16]。收集的乳腺癌樣本中有1例腫瘤直徑大小資料缺失，9例淋巴結轉移資料缺失，在剩余的乳腺癌病例中，腫瘤直徑小的FRY蛋白表達率高，差異有統計學意義（P<0.05）；未發生淋巴結轉移的表達率比發生淋巴結轉移的高，但差異無統計學意義（P>0.05）。

綜上，FRY蛋白在正常乳腺組織中的表達率比乳腺癌組織高，并且與乳腺癌組織學分級、TNM分期、腫瘤直徑大小及激素受體水平相關，表明FRY蛋白與乳腺腫瘤惡性程度存在一定的關系，提示它在細胞內的表達可對乳腺癌起抑制作用。對于認識FRY蛋白在乳腺癌預后判斷、指導臨床治療方面的作用提供了線索，為后續進一步研究FRY蛋白與乳腺腫瘤惡性程度的關系指明了方向。

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（張蕾編輯）

Expression of FRY and its significance in breast carcinomas with different degree of malignancy*

Fan Fei1,Chen-zi Zhang2,Jin-ming Zhao3,Hua-jun Chen4,Hai-nan Li4,Lin Yang2,Xue-feng Ren2,Qin-zhi Wei1,Xiao-jiang Tang2
(1.School of Public Health and Tropical Medicine,South Medical University,Guangzhou,Guangdong 510515,China; 2.Guangdong Medical Laboratory Animal Center,Foshan,Guangdong 528248,China; 3.The Sixth Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou,Guangdong 510655,China; 4.The First People's Hospital of Shaoguan,Shaoguan,Guangdong 512000,China)

Abstract:Objective To study the expression level of FRY protein in breast carcinomas of various degree of malignancy and its relationship with clinical pathological parameters.Methods One hundred and four cases of breast carcinomas were studied using immunohistochemical method,among which 11 cases had fibrocystic breast disease and 93 cases had invasive ductal carcinomas of breast.The expression level of FRY protein was determined,and the possible relationships between the FRY expression and a number of clinical pathological parameters were investigated.Results There was a significant difference in the positive rate of FRY expression between the fibrocystic breast disease cases and the breast invasive ductal carcinoma cases (90.9% vs 54.8%,P < 0.05).In the breast invasive ductal carcinomas,FRY expression was positively correlated with histological grades,TNM stages,tumor diameter and PR expression (P < 0.05).Conclusions The expression of FRY protein is strongly correlated with the malignant degree of breast carcinomas; the higher the malignancy of the carcinomas,the lower the expression level of FRY protein.Meanwhile,FRY expression is also related to progesterone receptor level in the body.

Keywords:FRY; tumor suppressor protein; breast neoplasm; malignant degree; immunohistochemistry

[通信作者]唐小江，E-mail：river-t@126.com，衛秦芝，E-mail：cnwei99@163.com

*基金項目：國家自然科學基金項目資助（No：81272904）

收稿日期：2015-11-17

文章編號：1005-8982（2016）06-0059-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.013

中圖分類號：R737.9

文獻標識碼：A