Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在子宮內膜腺癌中的表達及意義

李李　周龍書　史文靜

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Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在子宮內膜腺癌中的表達及意義

李李周龍書史文靜

【摘要】目的通過研究血管生成抑制蛋白Vasohibin-1、缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在正常增殖期子宮內膜(normal endometrium，NE)、子宮內膜非典型增生(endometrial atypical hyperplasia，EAH)和子宮內膜腺癌(endometrioid adenocarcinoma，EA)組織中的表達，探討上述指標與血管內皮生長因子(vascular endometrial growth factor，VEGF)及EA臨床病理特性的關系。方法采用免疫組織化學方法檢測Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在15例NE、30例EAH和50例EA組織中的表達，分析各指標之間及與EA臨床病理特性的關系。結果在EA組織中，Vasohibin-1、VEGF和HIF-1α的陽性表達率明顯高于NE組(P＜0.05) ; VEGF和HIF-1α的表達陽性率與EA臨床手術分期有關且隨期別升高而升高(P＜0.05)，而Vasohibin-1與臨床手術分期無關(P＞0.05) ;在EA組織中，Vasohibin-1、HIF-1α與VEGF的表達呈正相關(P＜0.01)，而Vasohibin-1與HIF-1α無相關性(P＞0.05)。結論Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α均在EA組織中高表達，Vasohibin-1在高水平的VEGF誘導下表達升高，但并不足以抑制EA組織中新生血管形成，可能存在其他旁路調節途徑來調節兩者之間的平衡。

【關鍵詞】子宮內膜腺癌; Vasohibin-1; VEGF; HIF-1α

子宮內膜腺癌(endometrioid adenocarcinoma，EA)是子宮內膜癌最常見的類型，占80%～90%，近年來該病發病率呈不斷上升趨勢，嚴重威脅女性的身體健康［1］。其中新生血管生成是大多數腫瘤形成的重要因素，而血管新生的調節則取決于血管生成因子與血管抑制因子的平衡。其關鍵因子是血管內皮細胞生長因子(vascular endometrial growth factor，VEGF)。最近研究發現VEGF的表達在基因水平上受轉錄因子缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的直接調控，而迄今為止發現的唯一可以通過負反饋調節VEGF進而發揮抗血管生成作用的調節蛋白為血管生成抑制蛋白Vasohibin-1［2］。本文通過研究Vasohibin-1、HIF-1α在正常增殖期子宮內膜(normal endometrium，NE)、子宮內膜非典型增生(endometrial atypical hyperplasia，EAH)和EA組織中的表達，從而探討上述指標與VEGF及EA臨床病理特性的關系，報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2009年5月至2014年5月我院EA石蠟包埋標本50例作為EA組?；颊吣挲g24～80歲，中位年齡54歲。術前均未經放、化療或激素治療。按2009年國際婦產科聯盟(FIG0)的分期標準，Ⅰ期20例、Ⅱ期15例、Ⅲ期13例、Ⅳ期2例;按有無淋巴結轉移情況分為:有淋巴結轉移12例，無淋巴結轉移38例;按腫瘤細胞分化級別分為G1、G2、G3級，每級為21、19、10例。按腫瘤的浸潤程度分:＜1/2肌層浸潤為17例，≥1/2肌層或漿膜浸潤為33例。收集同期EAH石蠟包埋標本30例作為EAH組，其中輕中度和重度各15例，患者年齡38～66歲，中位年齡48歲。取同期在我院因子宮肌瘤切除子宮患者的NE標本15例作為NE組，患者年齡32～53歲，中位年齡40歲。所有診斷均由兩位以上病理醫師確診。

1.2方法

1.2.1免疫組化:采用Envision二步免疫組化染色法。兔抗人HIF-1α多克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司，所用的兔抗人VEGF多克隆抗體和兔抗人CD34多克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發公司，鼠抗人vasohibin多克隆抗體購自臺灣Abnova公司。Envision二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6000)和DAB酶底物顯色試劑盒等相關試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。按Envision二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6000)說明操作，DAB顯色，蘇木精復染。已知的陽性對照片作陽性對照，PBS代替第一抗體作陰性對照。所有切片均采用同一批試劑完成。

1.2.2結果判斷標準:細胞質或核內如有棕黃色顆粒即判定為陽性。在隨機雙盲的條件下，兩名高年資病理科醫師對切片觀察，每張切片隨機選擇5個高倍鏡(×400倍)，200個細胞/視野，共計1 000個細胞并取其平均數。根據目前應用較為廣泛的免疫組化積分標準判斷:①染色強度:無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分，陽性細胞數:陰性0分，陽性細胞數≤10%1分，11%～50%2分，51%～80% 3分，＞80% 4分。②采用半定量積分對各子宮內膜組織行陽性/陰性劃分。半定量積分=染色強度評分×陽性細胞數評分。其中半定量積分0～1分定位陰性(－)，2～3分定位弱陽性(+)，4～6分定為中陽性(++)，＞6分定為強陽性(+++)。+～+++均為陽性，++～+++為過表達，－～+為表達缺失或低表達。

1.3統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，相關分析采用Spearman相關分析，以a=0.05(雙尾)為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α在3組子宮內膜組織中的表達情況

2.1.1Vasohibin-1在3組子宮內膜組織中的表達情況:在子宮內膜組織中，Vasohibin-1的陽性表達主要在細胞漿內，鏡下可見呈棕黃色顆粒樣染色。在15例NE組織中Vasohibin-1的陽性表達率為6.67%，在30 例EAH組織中的陽性表達率為16.67%，在50例EA組織中的陽性表達率為38%，三者呈逐漸遞增趨勢。NE組與EAH組的陽性率差異無統計學意義(χ2=0.22，P＞0.05)，但EA組的陽性表達率與NE組及EAH組差異有統計學意義(χ2=3.95、4.06，P＜0.05)。見圖1、表1。

圖1　EA中Vasohibin-1的陽性表達

表1　Vasohibin-1在3組子宮內膜組織中的表達情況　例

2.1.2VEGF在3組子宮內膜組織中的表達情況: VEGF陽性表達主要在子宮內膜組織的細胞漿內，呈棕黃色顆粒。VEGF在NE及EAH中陽性率分別為26.67%、40.00%，而EA組織中VEGF的陽性率為74.00%，陽性表達率逐漸升高。EA與NE組以及EAH組VEGF的陽性表達率之間差異均有統計學意義(χ2=11.10，9.13，P＜0.01)，而在NE和EAH組織中VEGF的表達差異無統計學意義(χ2=0.78，P＞0.05)。見圖2，表2。

圖2　EA中VEGF的陽性表達

2.1.3HIF-1α在3組子宮內膜組織中的表達情況: 與VEGF及Vasohibin-1不同，HIF-1α在子宮內膜組織中的陽性表達主要在細胞X核上，呈棕黃色顆粒染色。在NE、EAH及EA組織中，HIF-1α的陽性表達率分別為6.67%、43.33%、62.00%，呈逐漸升高趨勢。NE組與EAH組、EA組的陽性率的差異有統計學意義(χ2=4.68、14.13，P＜0.05)，而EAH組與EA組間比較差異無統計學意義(χ2=2.64，P＞0.05)。見圖3，表3。

表2　VEGF在3組子宮內膜組織中的表達情況　例

圖3　EA中HIF-1α的陽性表達

表3　HIF-1α在3組子宮內膜組織中的表達情況　例

2.2Vasohibin-1、VEGF及HIF-1α的表達與EA臨床病理特征的關系

2.2.1Vasohibin-1的表達與EA臨床病理特征的關系: Vasohibin-1在EA中的表達與病理分級、肌層浸潤、臨床手術分期、有無淋巴結轉移和年齡等因素均無關。見表4。

表4　Vasohibin-1的表達與EA臨床病理特征的關系　例

2.2.2VEGF的表達與EA臨床病理特征的關系: VEGF在EA組織中的表達與臨床手術分期有關(χ2=5.72，P＜0.05)，與病理分級、肌層浸潤、有無淋巴結轉移及年齡無關，隨著臨床手術的期別升高，VEGF的表達在子宮內膜組織中的表達陽性率升高。見表5。

表5　VEGF的表達與EA臨床病理特征的關系　例

2.2.3HIF-1α的表達與EA臨床病理特征的關系: HIF-1α在EA組織中的表達與臨床手術分期有關，(χ2=5.53，P＜0.05)，隨著臨床手術分期的期別升高，HIF-1α的表達陽性率升高，而與病理分級、肌層浸潤、有無淋巴結轉移及年齡無關，這與VEGF的表達與EA病理學特性的關系相似。見表6。

表6　HIF-1α的表達與EA臨床病理特征的關系　例

2.3VEGF、Vasohibin-1及HIF-1α在EA組織中表達的相關性

2.3.1EA組織中VEGF分別與Vasohibin-1、HIF-1α表達的相關性:在EA組織中，VEGF分別與Vasohibin -1、HIF-1α表達的呈同向變化，做相關性分析呈正相關(r分別為0.370、0.381，P＜0.01)。見表7。

2.3.2EA組織中Vasohibin-1與HIF-1α表達的相關性: Vasohibin-1與HIF-1α表達相關性分析，差異均無統計學意義(r=0.187，P＞0.05)。見表8。

表7　EA組織中VEGF與Vasohibin-1、HIF-1α表達的相關性分析例

表8　EA組織中Vasohibin-1與HIF-1α表達的相關性分析　例

3　討論

血管新生對腫瘤組織生長和轉移發揮重要的作用，研究表明腫瘤是通過調控血管生成因子和抑制因子之間的平衡來實現血管新生［3］。VEGF是已知最強的血管生成刺激因子之一。這種蛋白對血管內皮細胞具有特異性的促分裂增殖作用，同時具有極強的血管滲透性與細胞外基質互相聯系，進而有利于腫瘤血管新生及浸潤。本研究結果顯示，在EA組織中存在VEGF表達的明顯增高，同時VEGF的表達量與手術病理分期相關，而與EA細胞的分化、是否淋巴結轉移及肌層浸潤程度并無關系。這表明VEGF可能參與了EA的臨床進展，并與預后密切相關，這與既往研究結果［4，5］一致。

Vasohibin家族蛋白是新近發現的一類血管生成調節因子，研究表明其在血管新生過程中同樣發揮著重要作用［3］。Vasohibin-1是其家族的一員，主要作用是在血管內皮細胞血管新生的終止部位表達并終止血管新生。Vasohibin-1在卵巢癌、宮頸癌等婦科腫瘤中均存在廣泛的表達。同樣在子宮內膜癌中也可見廣泛表達，如Yoshinaga等［4］分析了78例子宮內膜癌患者的病理標本后認為，在各組織病理分期的EA的vasohibin表達都高于正常組織(P＜0.05)且表達水平與腫瘤病理分期呈明顯正相關。本研究結果表明在子宮內膜組織中，Vasohibin-1在NE、EAH以及EA組織中的陽性表達率呈逐漸遞增趨勢。而且EA組的陽性表達率遠遠高于NE組及EAH(P＜0.05)。這一結果與Yoshinaga等［4］的研究結果基本吻合。然而本研究中并未發現Vasohibin-1與病理分級存在明顯的關系，考慮可能與研究中所含G3期的病例數較少有關。

然而Vasohibin-1與VEGF之間表達的相關性，前期的研究結果并不一致。

有研究認為Vasohibin-1與VEGF在子宮內容癌微血管中表達呈明顯的一致性，且隨著子宮內膜癌從高分化到低分化而表達依次升高，并呈強烈的正相關［4，5］，本研究結果表明Vasohibin-1與VEGF之間存在著表達的密切相關性。王珺等［6］研究結果表明，EA組織中的Vasohibin-1并沒有在高水平的VEGF誘導下出現高表達，反而表達卻明顯降低。本研究結果表明Vasohibin-1與VEGF之間在EA組織中的表達呈明顯的正相關，進一步支持了上述研究結果［4，5］。Vasohibin-1同樣在乳腺癌［7］、宮頸癌［8］組織也呈高表達水平，并且表達與腫瘤的進展密切相關。Vasohibin-1作為血管新生的負反饋調節蛋白，其表達受多種因子的影響。如VEGF受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)及成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)可通過PKCδ途徑介導Vasohibin-1的表達［9］。因此推測機體對于高水平的VEGF刺激，可進一步誘導產生負反饋調節蛋白Vasohibin-1來調控腫瘤的血管新生過程。

HIF-1α是一種在缺氧條件下活化的轉錄因子，其與靶基因上的缺氧反應元件結合，激活VEGF等靶基因的轉錄［10］。缺氧條件下，活化的HIF-1α順式調節VEGF轉錄，使其過多表達，促進血管增生，改善組織氧供。本研究結果表明EAH及EA與NE中的HIF-1α表達具有顯著差異，而且其與VEGF的表達一樣與臨床手術分期有關(χ2=5.53，P＜0.05)，提示HIF-1α與VEGF相互協調共同促進EA血管生成中。然而Vasohibin-1與HIF-1α在腫瘤組織中表達的相關性卻并不明確，王智娜等［11］研究表明Vasohibin-1與HIF-1α在肝癌組織中均存在高表達且存在明顯相關性，并認為二者在肝癌發生發展過程可能通過VEGF發揮作用。然而在EA組織中本研究結果表明兩者之間表達并無明顯相關性(P＞0.05)。從本研究結果推測，說明隨著腫瘤的持續增長，細胞增殖加快，倍增時間進一步縮短，細胞內缺氧現象增加，缺氧的微環境通過HIF-1α的作用誘導VEGF表達水平持續上調，而Vasohibin-1未能在更高水平的VEGF的誘導下持續上調，可以在一定程度上解釋本研究中Vasohibin-1的表達與臨床手術分期無關，而VEGF和HIF-1α的表達卻臨床手術分期有關這一現象，同時也可以解釋本研究中Vasohibin-1與HIF-1α在EA組織中表達沒有明顯的相關性。另外有報道稱從正常子宮內膜血管內皮細胞中分離出一個小的Vasohibin結合蛋白SVBP，它可促進Vasohibin的溶解與分泌并維持其在內屏細胞中的含量進而阻止其泛素化作用，增強其抗血管生成活性［9］。但這種結合蛋白卻未在子宮內膜癌中檢測到，推測在子宮內膜癌組織中即使表達增加，然而活化的Vasohibin含量并不多。因此推測當腫瘤生長到一定階段，這一內源性Vasohibin-1的表達上調并不能抑制EA組織中新生血管的形成，EA血管繼續異常增生，最終導致腫瘤進展。

本研究結果在一定程度上解釋了EA組織中血管異常增生的原因。但是Vasohibin-1與HIF-1α之間的關系目前尚不清楚，所以Vasohibin-1與VEGF之間可能存在與HIF-1α作用類似的旁路調節途徑來調節兩者之間的平衡。探索vasohibin在EA中表達的調控途徑，促進其表達，將有望成為抑制EA血管生成的有效途徑和治療手段，成為治療EA的新靶點。

參考文獻

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·論著·

Expressions and significance of Vasohibin-1，VEGF，HIF-1α in endometrioid adenocarcinoma

LI Li，ZHOU Longshu， SHI Wenjing.
Department of gynaecology，The Second Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

【Abstract】Objective To investigate the expressions of vascular endometrial growth factor (VEGF)，hypoxia induced factor 1α(HIF-1α) and Vasohibin-1 in normal endometriums (NE)，endometrial atypical hyperplasia (EAH) and endometrioid adenocarcinoma (EA) tissues，and to explore the correlation between these indexes and clinicopathological characteristics of EA.MethodsThe expression levels of Vasohibin-1，VEGF and HIF-1α were detected by immunohistochemistry in 15 cases of NE，30 cases of EAH and 50 cases of EA tissues，and the correlation between these indexes and clinicopathological characteristics of EA was analyzed.Results The expressions levels of VEGF，HIF-1α，and Vasohibin-1 in EA tissues were significantly higher than those in NE tissues (P＜0.05).The expression levels of VEGF and HIF-1α were closely correlate to clinical surgical staging，which were increased with the advance of clinical stage (P＜0.05)，however，the expressions levels of Vasohibin-1 were not related with clinical surgical staging.The expressions of Vasohibin-1 and HIF-1α were positively correlated to those of VEGF in EA tissues (P＜0.01)，however，the expressions of Vasohibin-1 were not related with those of HIF-1α(P＞0.05).Conclusion The high－expression of Vasohibin-1，VEGF，HIF-1α is observed in EA tissues.The high levels of VEGF can increase the expression levels of Vasohibin-1，however，which can not inhibit neovascularization in EA tissues，thus，there may have the other bypass pathways to regulate the balance between them.

【Key words】endometrioid adenocarcinoma; Vasohibin-1; VEGF; HIF-1α

(收稿日期:2015－08－22)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.05.006

通訊作者:周龍書，510260廣州市，廣州醫科大學附屬第二醫院婦科; E-mail: lili.py@163.com

【中圖分類號】R 737.33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2016) 05－0662－05

作者單位: 510260廣州市，廣州醫科大學附屬第二醫院婦科