葡萄酒中白藜蘆醇含量不確定度的評定

王藝華，宋吉利（國家葡萄酒及白酒、露酒產品質量監督檢驗中心，山東煙臺264003）

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葡萄酒中白藜蘆醇含量不確定度的評定

王藝華，宋吉利
（國家葡萄酒及白酒、露酒產品質量監督檢驗中心，山東煙臺264003）

摘要：根據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS—GL06《化學分析中不確定度的評估指南》的原理與方法，建立了液相色譜測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的數學模型。對測量結果的不確定度來源進行分析，分別對A類不確定度和B類不確定度進行評定。計算了各不確定度分量、合成標準不確定度和擴展不確定度。結果表明，不確定度主要來源于測量重復性，其次為量器校準、標準物質純度和進樣針。

關鍵詞：不確定度；白藜蘆醇；液相色譜；葡萄酒

近幾年來，不確定度的概念在檢測分析領域日益受到重視[1-2]。1999年12月15日，國際標準化組織（ISO）和國際電工委員會（IEC）在共同發布的ISO/IEC 17025：2005標準[3]中明確規定，無論是校準實驗室還是測試實驗室，都必須建立并實施測量不確定度的評估程序，以確保測試結果的準確性和可靠性。這是測試實驗室通過ISO/IEC 17025：2005標準的一道新課題。

白藜蘆醇學名為1,2-二苯乙烯,它的產生與葡萄植株受真菌的感染或非生物刺激(如紫外輻射)有關。其多以其單體及糖苷（piceid，3，4'，5-三羥基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷）形式存在，故一般有4種存在形式：順式、反式白藜蘆醇和順式、反式白藜蘆醇糖苷。白藜蘆醇存在于葡萄中也存在于葡萄酒中，在大多數葡萄酒中反式結構占主導地位[4-9]。

白藜蘆醇的檢測方法主要有氣相法和液相法，目前多采用GB/T15038—2006[10]標準規定的方法。該方法是以高效液相色譜（HPLC）法測定其含量，但因該方法涉及提取、凈化、濃縮等步驟，添加回收率較低，對測定結果有較大影響，故對該方法進行部分改進，減少樣品處理步驟，提高測定結果的準確度。

本實驗根據國家計量技術規范JJF 1059.1—2012[11]標準的要求，對利用HPLC法測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的不確定度進行了分析和評定，并給出了標準的表示方法。

1　材料與方法

1.1材料、儀器和試劑

樣品：煙臺西夫拉姆有限公司生產的迪拉麗·高含量白藜蘆醇干紅葡萄酒。

儀器：Waters 2695高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）、BS210S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

試劑：反式白藜蘆醇標準品（Stanford Chemicals生產）、乙醇（分析純）、甲醇（分析純），實驗用水為超純水。除另有規定外，試劑均為分析純。

1.2測定方法

1.2.1標準溶液的測定

a.稱取標準品反式白藜蘆醇0.2000 g，用乙醇（分析純）溶解并定容至100 mL，配制成2 g/L的標準溶液。

b.吸取2 g/L的標準溶液2.00 mL，將乙醇定容至100 mL，配制成40 mg/L的標準使用液。

1.2.2樣品的測定

樣品的測定過程包括取樣、制樣和測定3個步驟。參照GB/T 15038—2006[10]中的檢測方法，優化檢測步驟為：移取葡萄酒樣品10.00 mL于100.00 mL容量瓶中，蒸餾水定容。稀釋液過0.45 μm濾膜，濾液即進HPLC分析。

1.3數學模型

根據1.2的測定方法，建立葡萄酒中白藜蘆醇含量測定的數學模型，如（1）式所示：

式中：X——試樣中白藜蘆醇的含量，mg/L；

C——由標準曲線得出的樣品溶液中白藜蘆醇的含量，mg/L；

V2——吸取葡萄酒樣品的體積，mL；

V1——樣品稀釋液總體積，mL；

Frec——添加回收率，%；

Frep——重復性校正因子。

由于葡萄酒系體態均勻的液體樣品，從而制得有代表性的樣品，故取樣代表性產生的不確定度可以忽略不計，則（1）式即為白藜蘆醇含量測定的不確定度數學模型。

從數學模型可以看出，各影響參數相互獨立，且各參數的不確定度直接對被測量X的不確定度產生影響，即靈敏系數等于1，合成標準不確定度可以用相對標準不確定度進行合成，根據JJF 1059.1—2012[11]中6.7，合成標準不確定度uCrel表示為：

由公式（1）和公式（2）可推導出測試樣品的相對合成標準不確定度計算公式：

2　不確定度的來源分析

計算不同的不確定度分量時，應利用在實驗室內驗證試驗研究的測定數據。本測定方法不確定度從總體上考慮，分為以下3種：（1）測量重復性引入的不確定度分量ur（Frep）；（2）總偏差（回收）引入的不確定度分量ur（Frec）；（3）不能全面考慮的其他影響因素有關的不確定度，主要是樣品測試全過程引入的其他不確定度分量ur。

2.1測量重復性引入的不確定度分量ur（Frep）

對不同樣品進行一系列平行測試（同一均勻樣品、完整的提取/測定程序），以獲得該分析程序的總的隨機變化（精密度）。

2.2偏差引入的不確定度分量ur（Frec）

分析程序的偏差是通過在實驗室內部確認研究中使用加料樣品進行的研究。

2.3樣品測試全過程引入的不確定度分量ur

2.3.1標準溶液測定過程引入的不確定度ur（C）

主要包括：標準物質純度引入的不確定度；稱量產生的不確定度；標準溶液配制過程量器產生的不確定度；10 μL進樣針準確度引入的不確定度；HPLC儀器準確度引入的不確定度分量。

2.3.2樣品測定過程引入的不確定度ur（V）

主要包括：樣品制備過程量器產生的不確定度；10 μL進樣針準確度引入的不確定度；HPLC儀器準確度引入的不確定度分量。

3　測量不確定度分量的分析和評定

根據標準不確定度的來源分別進行不確定度的評定。

3.1測量重復性引入的不確定度分量ur（Frep）

測量重復性引入的不確定度分量ur（Frep），樣品反復進行10次分析，見表1。

表1 測量重復性引入的不確定度

ur（Frep）=s1/ x=1.03×10-2。（A類不確定度）

3.2總偏差引入的不確定度分量ur（Frec）

5個樣品的添加回收率分別為82 %、85 %、90 %、91 %、80 %，平均回收率為85.6 %，標準偏差s為4.8 %。

標準不確定度采用平均值的標準偏差：

ur（Frec）=0.048/309.9=1.55×10-4。（A類不確定度）3.3樣品測試全過程引入的不確定度分量ur（B類不確定度）

3.3.1標準溶液引入的不確定度ur（C）

3.3.1.1標準物質純度引入的不確定度ur1

3.3.1.2稱量產生的不確定度ur2

以減量法稱取標準物質的質量0.2015 g。稱量使用萬分之一數字電子天平，計量證書標明其線性為±0.15 mg，采用矩形分布，k=，天平的線性分量為：

減量法稱量過程天平使用2次，故稱量白藜蘆醇產生的標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

3.3.1.3標準溶液配制過程量器產生的不確定度ur3

標準溶液配制過程中所用量器為：2個100 mL單標線容量瓶、1個2 mL單標線移液管。按照《化學分析中不確定度的評估指南》[13]，100 mL容量瓶的體積有3個主要影響因素：校準、重復性和溫度。

（1）校準：證書給出的容量瓶在20℃下的體積為100 mL±0.1 mL，計算標準不確定度時假設為三角形分布：

（2）重復性：由于充滿容量瓶的變化引起的不確定度可通過該容量瓶的典型樣品的重復性實驗來評估。對典型的100 mL容量瓶充滿10次并稱量的實驗，得出標準偏差為0.02 mL，可直接用作標準不確定度。

（3）溫度：根據證書提供的信息，該容量瓶已在20℃校準，而實驗室的溫度在±3℃之間變動。該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數來進行計算。液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮前者即可。乙醇的體積膨脹系數為0.75× 10-3/℃，因此產生的體積變化為：

±（100×3×0.75×10-3）=±0.225 mL。

計算標準不確定度時假設溫度變化是矩形分布，即：

3種分量合成得到體積的標準不確定度：

其相對標準不確定度為：

對于2 mL單標線移液管，只考慮由校準引入的不確定度。證書給出的移液管在20℃下的體積為2 mL± 0.008 mL，按照矩形分布考慮，k=，標準不確定度為：

3.3.1.4 10 μL進樣針準確度引入的不確定度ur4

3.3.1.5 HPLC儀器的準確度引入的不確定度ur5

5種分量合成得到標準溶液產生的不確定度ur(C)：

3.3.2樣品產生的不確定度ur(V)

3.3.2.1樣品制備過程量器產生的不確定度ur6

樣品制備過程中所用量器為：100 mL單標線容量瓶、10 mL單標線移液管。

100 mL容量瓶體積的3個影響因素產生的不確定度：

（2）重復性：0.02 mL；

（3）溫度：水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，因此產生的體積變化為：

±（100×3×2.1×10-4）=±0.063 mL。

計算標準不確定度時假設溫度變化是矩形分布，即：

3種分量合成得到體積的標準不確定度：

其相對標準不確定度為：

對于10 mL單標線移液管，只考慮由校準引入的不確定度。證書給出的移液管在20℃下的體積為10 mL± 0.010 mL，按照矩形分布考慮，k=，標準不確定度為：

其相對標準不確定度為：

3.3.2.2 10 μL進樣針準確度引入的不確定度u7

表2 標準不確定度一覽表

證書給出的公差為±0.02 μL，按照矩形分布考慮，k=，標準不確定度為：

3.3.2.3 HPLC儀器的準確度引入的不確定度u8

由證書可知，σ＝0.0018 mg/kg，按照矩形分布考慮，k=，標準不確定度為：

3種分量合成得到標準溶液產生的不確定度ur(V)：

3.3.3合成標準不確定度計算（表2）

合成相對不確定度：

3.3.4擴展不確定度通過使用包含因子k=2計算得出：

U95=1.09×10-2×2×309.9=6.76≈6.8 mg/L。

3.3.5不確定度報告

本次檢測葡萄酒中白藜蘆醇含量為：309.9 mg/L，U= 6.8 mg/L；k=2。

4　小結

本文評定了液相色譜法測定葡萄酒中白藜蘆醇含量的不確定度，通過評定可以初步得出如下結論：在評估白藜蘆醇測定方法的不確定度過程中，測量重復性、標準溶液測定和樣品測定對不確定度的貢獻較大，其中測量重復性貢獻最大。深入分析可知，標準溶液測定過程中主要的不確定度來源為：量器校準、標準物質純度和進樣針準確度；樣品測定過程中主要的不確定度來源為：進樣針準確度。

因而在評定葡萄酒中白藜蘆醇含量不確定度過程中，應主要考慮測量重復性引入的不確定度的影響，其次考慮量器校準、標準物質純度和進樣針等所引入的不確定度的影響。

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Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Resveratrol Content in Grape Wine

WANG Yihua and SONG Jili
(China National Wine Quality Supervision and Inspection Center, Yantai, Shandong 264003, China)

Abstract:Based on JJF 1059.1-2012 and CNAS-GL06, the mathematical model had been developed for the determination of resveratrol content in grape wine by HPLC. The source of the uncertainties in the measurement was analyzed, and Type A and Type B uncertainties were assessed respectively. Each uncertainty component, combined standard uncertainty and expanded uncertainty were calculated. The results showed that the uncertainty mainly came from gauge repeatability, calibration of volumetric apparatus, standard material purity and injection needle.

Key words:uncertainty; resveratrol; high performance liquid chromatography (HPLC); grape wine

作者簡介：王藝華(1981-),女,碩士,工程師,主要從事葡萄酒檢測工作。

收稿日期：2015-12-17

DOI：10.13746/j.njkj.2015470

中圖分類號：TS262.6；TS261.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）04-0102-04

優先數字出版時間：2016-02-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1734.005.html。