雙孔鉀離子通道TASK-1、TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達*

范 文方勝英周 慧梅紅彬

1. 武漢市優撫醫院（武漢 430022）；2. 華中科技大學同濟醫學院計劃生育研究所/生殖醫學中心

·論 著·

雙孔鉀離子通道TASK-1、TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達*

范 文1方勝英1周 慧2**梅紅彬1

1. 武漢市優撫醫院（武漢 430022）；2. 華中科技大學同濟醫學院計劃生育研究所/生殖醫學中心

目的探討雙孔鉀離子通道TASK-1、TRAAK在精子中的表達水平及TASK-1、TRAAK在弱精子癥發生機制中的作用。方法采用非連續密度梯度離心分離、純化正常對照組精液標本20例和弱精子癥組精液標本30例，提取精子總RNA后，采用RT- PCR，SYBR Green 實時定量PCR檢測精子中TASK-1、TRAAK mRNA的相對表達量。結果TASK-1、TRAAK mRNA在正常對照組和弱精子癥組精子中均有表達；其中，TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達量明顯低于其在正常對照組精子中的表達量，下降2.3倍，兩組之間有明顯的統計學差異（P＜0.05），TASK-1在弱精子癥患者精子中的表達量與其在正常對照組精子中的表達量沒有明顯差異（P＞0.05）。結論TRAAK基因在弱精子癥患者精子中的表達下調可能與精子活力下降有關，提示TRAAK可能成為弱精子癥發病機制研究的一個分子靶標。

雙孔鉀離子通道; 弱精子癥; 逆轉錄聚合酶鏈反應

弱精子癥是男性不育的重要原因之一。有報道稱[1]，超過80%的男性不育與精子運動障礙有關，其中大約20%與精子活動力低下有著直接關系。隨著基因敲除技術的發展，目前已有多種動物模型證實近300個基因與男性不育有關，其中包括一些精子動力相關基因如Tektin4 基因[2]、CATSPER1基因[3]、TCTE3基因[4]等。雙孔鉀離子通道（Two-pore domain potassium channels, K2P）是上世紀90年代發現并克隆一種含4個跨膜片段和2個孔道結構域的鉀離子通道亞型，由于K2P通道可以在靜息電位處開放，因而也被稱為背景鉀通道或 漏流鉀通道。K2P通道依據結構和功能的性質可被劃分為6個亞類：（1）TWIK-1、TWIK-2和KC-NK7；（2）TASK-1、TASK-3和TASK-5；（3）TREK-1、TREK-2 和TRAAK；（4）TASK-2、TALK-1和TALK-2；（5）THIK-1和THIK-2；（6）TRESK。其基因則以KCNK來命名。K2P通道表達分布非常廣泛，幾乎在各種組織細胞都能發現它們的存在，在不同的組織，K2P通道具有不同的功能。其中，TASK-1[5]廣泛表達于中樞神經系統和外周組織，參與維持細胞膜的靜息電位和調節細胞的興奮性，具體在不同的組織細胞中它有著不同的生理功能；TRAAK[6]在小腦中有相對特異和高水平的表達，提示它的活性與神經系統的病理生理過程密切相關。然而，目前尚缺少TASK-1、TRAAK在人類生殖細胞的表達及其與弱精子癥發生機制相關的研究。本研究采用 RT- PCR檢測TASK-1、TRAAK mRNA在正常男性和弱精子癥患者精子中表達有無差異，從而為進一步探討弱精子癥的發生機制提供實驗基礎和理論依據。

資料與方法

一、資料

（一）研究對象

20例正常男性對照組（年齡22~45歲）精液標本來自2015年8~12月健康體檢合格供精志愿者，精子濃度≥15×106/mL，精子活力[（a+b）級精子]百分率≥40%；30例弱精子癥組患者（年齡21~47歲）精液標本來自華中科技大學同濟醫學院生殖醫學中心，精子濃度≥15×106/mL，精子活力[（a+b）級精子]百分率＜40%，兩組間年齡無統計學差異，精液量、pH、液化時間、正常形態精子百分率均正常，所有的樣本均排除支原體、衣原體感染，附睪或睪丸炎，系統性疾病病史，且精漿生化、生殖激素、常規體格檢查正常。

（二）主要試劑及儀器

Percoll（Pharmacia，美國），RNA提取試劑盒（Qiagen，德國），RT-PCR試劑盒（TOYOBO，日本），實時熒光定量PCR試劑盒（TOYOBO，日本），其余試劑均為分析純；WLJY-9000偉力彩色精子質量檢測儀（中國），LineGene 9620實時熒光定量PCR儀（BIOER，中國）。

二、方法

（一）Percoll法分離精液

液化后的精液樣本采用WLJY-9000偉力精子質量分析儀分析，按其活力分為正常組和弱精子癥組。入選樣本按文獻[7]采用Percoll（取80%和40%兩個濃度） 純化精子，收集80%層底部精子，加入5mL體細胞裂解液（0.1%十二烷基硫酸鈉，0.5% TritonX-100，用RNase-free水配制，4℃保存，臨用前取出冰?。?，吹打分散沉淀，置冰浴15 min，間斷吹打，用0.01mol/L PBS（pH 7.4）洗滌3次，顯微鏡下確認無圓形細胞，計數精子密度。

（二）精子總RNA的提取及逆轉錄

根據精子密度取1×1 07精子懸液，室溫12 000×g，離心2 min，棄上清，精子沉淀用RNeasy Mini Kit 提取RNA，按照試劑盒說明進行操作。RNA 提取主要步驟：精子沉淀加入600μL提取緩沖液RLT，用吸管尖頭反復吹打30s，反復通過20G一次性注射器針頭10次剪切DNA；加入等體積70%乙醇，吹打混勻后移至吸附柱10 000×g，室溫離心30 s，棄洗脫液；加700μL漂洗緩沖液RW1至吸附柱，10 000×g，室溫離心30 s， 棄洗脫液；加500μL漂洗緩沖液RPE至吸附柱，10 000×g，室溫離心30 s，棄洗脫液；加500μL漂洗緩沖液RPE至吸附柱，12 000×g，室溫離心2 min，棄洗脫液；加30μL RNase-free水（用前預熱至70℃）至吸附柱的膜上，12 000×g，室溫離心1 min，收集管中洗脫所得即為細胞總RNA。取5μL RNA，用UA-1800核酸測定儀測定其純度和含量，剩余RNA參照試劑盒方法馬上逆轉錄，所得cDNA作為模板用于熒光定量擴增。

（三）熒光定量PCR

參照實時熒光定量PCR試劑盒方法及PCR儀使用方法，實時定量 PCR 反應體系為：上、下游引物各1.2μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 15μL，cDNA 2μL，補RNase- free水至30μL。反應條件為：95℃預變性60s；95℃15s，59℃20s，72℃45s，共45個循環，其中72℃45s階段采集熒光。內參β-Actin、TASK-1和TRAAK基因引物由北京奧科生物技術有限公司設計并合成，序列見表1。TASK-1、TRAAK mRNA的表達采用△△Ct法進行相對定量分析?！鳌鰿t=（實驗組內參基因Ct值﹣對照組內參基因Ct值）﹣（實驗組待測基因Ct值﹣對照組待測基因Ct值）?；虻谋磉_差異為：2﹣△△Ct。2﹣△△Ct＞2為表達上調，2﹣△△Ct＜0.5為表達下調，2＞2﹣△△Ct＞0.5為表達無明顯變化。

表1 PCR引物序列

三、統計學分析

實驗數據應用 SPSS 17.0 軟件分析，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，數據以x±s表示，P＜0.05表明差異具有統計學意義。

結 果

一、TASK-1基因在正常對照組和弱精子癥組中的相對表達量

正常對照組樣本20例和弱精子癥組樣本30例，TASK-1 mRNA的表達水平如表2所示?？梢钥闯鋈蹙影Y樣本TASK-1 mRNA的表達水平較正常對照組無明顯變化（P＞0.05）。

二、TRAAK基因在正常對照和弱精子癥組中的相對表達量

正常對照組樣本20例和弱精子癥組樣本30例，TRAAK mRNA的表達水平如表3所示?？梢钥闯鋈蹙影Y樣本TRAAK mRNA的表達水平較正常對照組顯著降低（P＜0.05）。

表2 正常對照組和弱精子癥組中TASK-1 mRNA的表達量（

表2 正常對照組和弱精子癥組中TASK-1 mRNA的表達量（

與正常對照組比較，△P＞0.05，△Ct值=待測基因Ct值﹣內參基因Ct值

組別 n Ct (TASK-1) Ct (β-Actin) △Ct △△Ct 2﹣△△Ct對照組 20 24.35±0.87 20.95±1.02 3.38±0.93 0±0.93 1弱精癥組 30 24.75±1.0 21.53±0.91 3.22±0.84△0.16±0.84 0.9

表3 正常對照組和弱精子癥組中TRAAK mRNA的表達量

表3 正常對照組和弱精子癥組中TRAAK mRNA的表達量

與正常對照組比較，﹡P＜0.05，△Ct值=待測基因Ct值﹣內參基因Ct值

組別 n Ct (TRAAK) Ct (β-Actin) △Ct △△Ct 2﹣△△Ct對照組 20 29.33±2.07 20.95±1.02 8.38±2.24 0±2.24 1弱精癥組 30 28.66±1.98 21.53±0.91 7.12±2.04*1.26±2.04 0.42

討 論

不孕不育的診斷和治療在臨床上已經廣泛開展，其中弱精子癥是男性不育的主要原因之一，它的病因和病理復雜多樣，但其顯著特征是精子運動能力下降。對弱精子癥的探討也成為學者近年來研究的重要課題。為了深入了解弱精子癥的發病機制，人們從分子水平進行了大量的研究，發現了一些與弱精子癥相關的基因和蛋白，如基因tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP4、SEPT4、Smcp，蛋白ACTB、ANXA5、PRM1、PRM2、SABP等均被證實與弱精子癥的發生有關[8]，其中大部分與鞭毛的軸絲、線粒體、外周致密纖維相關，但在很大程度上精子動力缺陷的確切分子機制仍不明朗。離子通道可以使精子適應不斷變化的微環境，對精子運動、精子活化、頂體反應及受精過程中的趨卵運動十分重要。作為細胞內重要的第二信使，在精子質膜上，Ca2+信號通過質膜上Ca2+相關通道來調節胞內Ca2+濃度的變化，這些通道均被證實存在于精子尾部鞭毛上，在精子運動調控方面發揮著重要作用[9]。其中CatSper通道在精子運動、精子超活化和受精中的作用已有較好的研究，是目前公認的哺乳動物精子細胞上最重要的Ca2+通道[10]。作為CRISPs家族中激素非依賴性,且唯一特異性表達于睪丸的蛋白，CRISP2定位于精子頂體和尾部的外致密纖維鞘，它通過RyR受體調控Ca2+通道的活性,參與精子鞭毛運動的調節、頂體反應和精卵融合等過程[11]。K+通道在精子獲能及頂體反應的誘發中也起著舉足輕重的作用。其中Slo3是精子特異性K+通道，是生理條件下在精子中起主要作用的K+通道，人和小鼠的Slo3具有組織特異性，均只在睪丸和精子中表達，它介導成熟精子產生pH依賴性鉀電流，調控與細胞膜電位相關的信號過程，從而影響雄性生育[12]。作為K2P家族的成員，TASK-1通道對缺氧和pH值變化敏感，參與了呼吸的化學調控[13]，能夠調節肺動脈平滑肌細胞收縮[14]，參與形成心肌動作電位平臺期[15]，調節醛固酮分泌[16]，還是許多麻醉劑的靶標[17,18]；TRAAK通道可以被多不飽和脂肪酸、機械張力、細胞內堿性條件所激活[19]，在病理狀態下對腦缺血提供一種保護機制[20]。Chow等[21]通過免疫印跡和免疫熒光分析附睪的精子樣本，第一次證實K2P通道TASK-2、REK-1和TRAAK在非人類靈長類動物的精子中有表達，并且K2P受體激動劑二十二碳六烯酸使表達增強，拮抗劑釓使表達減弱。Hur等[22]首次證明K2P通道在牛生殖器官和生殖細胞的表達，KCNK3、KCNK9、KCNK2、KCNK10、KCNK4在卵巢中、睪丸、卵母細胞、胚胎和精子中均有表達，其中KCNK10、KCNK4在卵母細胞細上有高表達，KCNK3、KCNK4在精子頭部高表達。這些均提示K2P通道可能介導生殖細胞的背景K+電導并調節其各種生理過程，如發生、成熟和受精。然而，目前并沒有K2P通道在人精子上表達的報道。為了研究K2P通道是否在精子中表達及弱精子癥的發生是否與K2P通道有關，我們選取了K2P通道中的亞類TASK-1、TRAAK作為研究，通過 RT- PCR證實，TASK-1、TRAAK mRNA在成熟精子中均有表達，與正常男性相比，弱精子癥患者精子中TRAAK表達明顯下降，但TASK-1的表達沒有變化。由此可以推斷，弱精子癥患者精子中TRAAK表達的下降，可能會導致精子活力低下。然而，考慮到TREK-1、TREK-2 和TRAAK結構和功能的相似性，其中一種K2P表達的改變可能導致其他K2P表達的變化，因此同時檢測三者在弱精子癥患者精子中的表達差異可能優于單個指標。另外，雖然研究結果表明TRAAK mRNA在弱精子癥患者較正常人表達下調約2.3倍（P＜0.05） ，但由于生物體內 mRNA的表達與蛋白質表達程度往往是不一致的，而真正生物學功能的執行者是蛋白質，因此后續我們會采用 Western印跡技術在蛋白水平上對TRAAK進行進一步檢測?？傊?，TRAAK在弱精子癥患者精子中的表達下降，可能是導致精子活力低下的原因之一，但是還需對TRAAK的表達下調的機制以及K2P之間的相互作用作進一步的深入研究。K2P在男性生殖中可能起著十分重要的作用。TRAAK可能是弱精子癥發病機制的一個重要分子靶標，值得進一步深入研究。

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（2016-07-08收稿）

Expression of K2P channel TASK-1, TRAAK in the ejaculated sperm of asthenozoospermic men*

Fan Wen1, Fang Shengying1, Zhou Hui2**, Mei Hongbin11. YouFu Hospital of Wuhan City, Wuhan 430022, China; 2 Centre of Reproductive Medicine and Family Planning Research
Institute, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Zhou Hui, E-mail: zhouhui10191@sina.com

ObjectiveTo investigate the expression level of K2P channel TASK-1, TRAAK in the sperm cells and the role of TASK-1, TRAAK in the pathogenesis of asthenozoospermia.MethodsSemen samples were collected from 20 normal controls and 30 asthenozoospermia patients and purified using Percoll discontinuous density gradients; after extracted the total RNA, the relative expressions of TASK-1, TRAAK mRNA were detected in the two groups by RT- PCR, SYBR Green real- time PCR.ResultsTASK-1, TRAAK mRNA were expressed in the sperm cells both in the normal control group and the asthenozoospermia patient group; the expression of TRAAK mRNA was down- regulated by 2.3 times in the asthenospermia patients, signifcantly lower than in the normal control group (P<0.05), while, there was no signifcant difference of TASK-1 mRNA in the two groups (P>0.05).ConclusionThe down- regulation of TRAAK mRNA in the sperm of asthenospermia patients may be related with decreased sperm motility, which suggests that TRAAK may serve as a potential molecular target for the research of asthenospermia．

K2P channel; asthenozoospermia; reverse transcriptase polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.002

R 698.2

資助：本課題受湖北省衛生計生科研項目基金資助（WJ2015MB254）

**通訊作者，E-mail: zhouhui10191@sina.com